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分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

细菌人工染色体的应用

2019.9.12

           

实验方法原理 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, RAC ) 是以大肠杆菌致育因子 (fertility, F)为基础的合成载体。
实验材料

限制性内切核酸酶 大肠杆菌培养物 电转感受态大肠杆菌细胞

试剂、试剂盒

LB 冷冻缓冲液

仪器、耗材

脉冲场凝胶电泳仪 LB 琼脂平板 LB 培养基 电穿孔仪

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液与溶液

LB 冷冻缓冲液

2. 酶与缓冲液

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

脉冲场凝胶电泳仪

4. 培养基

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基

5. 专用设备

电穿孔仪

6. 载体与菌株

BAC DNA 或 BAC 分离物转化的大肠杆菌培养物

冷冻的电转感受态大肠杆菌细胞

二、方法

1. 制备新鲜的 BAC 转化子。

(1) 如果 BAC 是以 DNA 的形式提供的

① 用电穿孔法将 BAC DNA 导入大肠杆菌（DH10B 菌株）中。

② 从每批电穿孔后的菌液分别取出 2.5、25 和 250 μl，涂布于含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板上。37℃ 温育平板 16~24 h。

(2) 如果 BAC 是以转化菌液的形式提供的

① 立即在含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板上划线培养。

② 37℃ 温育 12~16 h。

2. 挑选 12 个转化菌落，分别加入 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基中。37℃ 剧烈振摇过夜。

3. 在每 12 管 5 ml 培养液中各取 1 菌环，分别接种于 LB 冷冻培养基中培养。待细菌生长后，转移至 -20℃ 冷冻保存。

4. 从步骤 2 每个 5 ml 菌液中取 4.5 ml，纯化 BAC DNA。

5. 分析 BAC DNA

(1) 用 PCR 法或用 SouAem 杂交鉴定 BAC 含有染色体的目的区域。

(2) 用限制酶切和 PFGE 检测插入片段的大小。

6. 根据检测结果，选一个或多个 BAC 作进一步分析。

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细菌人工染色体
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