细菌人工染色体的应用
实验方法原理 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, RAC ) 是以大肠杆菌致育因子 (fertility, F)为基础的合成载体。
实验材料 限制性内切核酸酶大肠杆菌培养物电转感受态大肠杆菌细胞
试剂、试剂盒 LB 冷冻缓冲液
仪器、耗材 脉冲场凝胶电泳仪LB 琼脂平板LB 培养基电穿孔仪
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
LB 冷冻缓冲液
2. 酶与缓冲液
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
脉冲场凝胶电泳仪
4. 培养基
含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板
含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基
5. 专用设备
电穿孔仪
6. 载体与菌株
BAC DNA 或 BAC 分离物转化的大肠杆菌培养物
冷冻的电转感受态大肠杆菌细胞
二、方法
1. 制备新鲜的 BAC 转化子。
(1) 如果 BAC 是以 DNA 的形式提供的
① 用电穿孔法将 BAC DNA 导入大肠杆菌（DH10B 菌株）中。
② 从每批电穿孔后的菌液分别取出 2.5、25 和 250 μl，涂布于含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板上。37℃ 温育平板 16~24 h。
(2) 如果 BAC 是以转化菌液的形式提供的
① 立即在含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板上划线培养。
② 37℃ 温育 12~16 h。
2. 挑选 12 个转化菌落，分别加入 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基中。37℃ 剧烈振摇过夜。
3. 在每 12 管 5 ml 培养液中各取 1 菌环，分别接种于 LB 冷冻培养基中培养。待细菌生长后，转移至 -20℃ 冷冻保存。
4. 从步骤 2 每个 5 ml 菌液中取 4.5 ml，纯化 BAC DNA。
5. 分析 BAC DNA
(1) 用 PCR 法或用 SouAem 杂交鉴定 BAC 含有染色体的目的区域。
(2) 用限制酶切和 PFGE 检测插入片段的大小。
6. 根据检测结果，选一个或多个 BAC 作进一步分析。
