DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组的载体-3
在作为载体时，这些噬菌体有一个很大的优点，即克隆到M13mp载体的外源DNA片段（双链），在子代噬菌体便成为了单链形式。故应用M13mp进行克隆，可方便地分离到大量含有外源DNA某一单链的DNA分子。这种单链DNA可在下列工作中作模板：①主要用作双脱氧链终止法进行DNA序列测定的模板；②制备仅有一条链得到放射性标记的杂交用DNA探针；③利用寡核苷酸进行定点诱变。
M13mp18/M13mp19
三、真核细胞的克隆载体
无论是原核还是真核系统的基因克隆载体，作为载体都应具备三个相似的基本条件，即具备在宿主中进行复制的复制信号、适当的单一酶切位点和方便的选择标记。在原核载体的基础上进行适当的改造，可构建出带有真核细胞复制信号的穿梭载体，使之能在真核系统中扩增。若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因。为了鉴定和获得阳性转染细胞株，真核系统载体还必需具备适当的筛选标记。一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如TK基因产物）。另一种普遍使用的是抗新霉素基因。真核系统载体种类很多，各具特色和用途，并且正在不断被改进、完善，我们仅举例简要介绍。
㈠ SV40（猿猴病毒）载体
SV40基因组为约5.2kb的双链DNA分子，碱基顺序已完全清楚，且对其生活习性和各基因的调控也有较深的了解。同其他哺乳动物的DNA病毒一样，SV40能在细胞中形成较高的拷贝数并具有强大功能的启动子。因此，当今许多真核表达载体中的调控元件大都取材于SV40的调控顺序和复制信号。一般以取代方式构建SV40重组子，天然SV40中能插入2.5kb的外源DNA片段。用SV40作为载体有两种方式：①用SV40
DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒；②重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。
由于天然SV40病毒作为载体有诸多缺陷，实际上已很少使用。常通过使用SV40中的转录元件构建成穿梭载体克服其局限性。所谓穿梭载体是一类既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中表达复制的载体。PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体，全长3.9kb，由来自噬菌体、质粒和SV40病毒的DNA元件构建而成（图7-6）。PSVK3具有下列构件：
1．原核系统构件：①复制子（质粒复制起始位点和丝状噬菌体复制起始位点fl）；②筛选标志（Ampr）；③启动子（T7启动子）。
2．真核系统构件：①复制起始信号（SV40）；②启动子（SV40早期启动子）。
3．RNA修饰信号：①SV40小T抗原拼接信号；②SV40早期区mRNA polyA加尾信号。
4．多克隆位点 在SV40启动子下游存在8个酶切位点。
pSVK3质粒
㈡ 反转录病毒载体
反转录病毒为单链RNA病毒，长约8～10kb，有类似真核mRNA的5′-甲基化帽和3′-polyA尾的结构。所有反转录病毒一般由核心蛋白基因、反转录酶基因和外壳糖蛋白基因三个共同的基因组成。许多反转录病毒尚有编码转化蛋白的癌基因，可转化细胞。另外，在反转录病毒基因组的两端还分别有一个长的末端重复序列（long
terminal repeat, LRT）,LRT中含有一个很强的启动子。
反转录病毒载体（retrovial
vector）具有几个特点：①这类病毒具有广泛的哺乳动物细胞宿主；②病毒基因组有较大的容量，能插入7kb大小甚至更大的外源基因；③病毒基因组自身含有完整高效的调控元件；④病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在。⑤反转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系。
反转录病毒既可以构建成表达载体，即以完整的天然病毒双链为基础，外源DNA片段取代病毒中的癌基因,亦称为御甲载体（disarmed
vector）；也可以构建成穿梭载体（shuttle
vector），由反转录病毒LRT、包装信号等元件及质粒的原核复制、筛选元件重组而成。这类载体已成为动物细胞内表达外源基因的有力工具，并且正在临床基因治疗探索中发挥着重要的作用，当然其安全性有待进一步探索。
反转录病毒载体是一种向真核细胞转移基因的有力工具，但亦有其局限性：①反转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞，因此限制了其应用范围；②其装载容量较小，仅8kb左右，不适用于较大的基因；③其安性问题，最大的危险是制剂过程中可能存在具有复制能力的野生型病毒，可能造成细胞或机体的感染和破坏。因此反转录病毒载体的构建、改造及包装细胞的选用，原则上都应避免产生有复制能力的野生型病毒。
四、人工染色体
常用的λ噬菌体载体能装载的插入片段长约24kb，粘粒载体能接受的插入片段约35~45kb。由于许多基因过于庞大而不能作为单一片段克隆于这些载体之中，以及建立真核生物染色体物理图及克隆其大节段的需要，二十世纪八十年代提出了建立人工染色体（artificial
chromosome）的概念和方法。在1983年成功地构建了第一条酵母人工染色体（yeast artificial
chromosome,YAC）以来，人工染色体的研究和应用不断发展并取得了令人鼓舞的成就。继YAC后，细菌人工染色体（BAC）、噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC）和哺乳动物人工染色体（MAC）相继问世。这里仅介绍YAC系统。
YAC是主要由着丝粒、端粒（telomere）、复制子和外源DNA构成的线状DNA分子，具有天然酵母染色体的许多特征和生物性状。YAC主要包括以下调控元件：①着丝粒，以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞；②端粒，作为染色体复制所必需的元件，具防止染色体被核酸外切酶降解的功能；③复制起始点和限制性酶切位点；④筛选标记，YAC载体的两臂均带有选择标记，在酵母中选择标记一般为色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选；⑤原核序列及调控元件，包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作。
YAC作为载体的主要特点是：①酵母是单细胞真核生物，可以似大肠杆菌一样方便进行培养；②酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物的基因；③装载容量巨大，可达百万个碱基对（Mbp）水平，比常用的λ噬菌体载体和粘粒载体至少大十倍。
YAC的克隆程序相似于基因组DNA的常规克隆，DNA在片段连接到YAC载体的（两）臂上形成重组体，随后该重组体可通过常规方法导入酵母。在酵母中能准确地进行有丝分裂和减数分裂，而且还能生成蛋白产物。另外，还可以构建酵母穿梭质粒，是将酵母染色体中与复制子、染色体稳定性及表达相关的元件，同质粒（如pBR322）组建在一起。这种酵母穿梭质粒带有质粒的复制起始位点和抗药基因（如Ampr和Tetr），能在大肠杆菌中复制，并在真核细胞中表达。
目前，人工染色体尤其是YAC作为大分子外源DNA的克隆载体而广泛应用于各种生物基因组计划。已成为绘制基因图谱、研究基因结构与功能、遗传病基因鉴定和产生转基因动物的重要工具。由于其装载容量大，利用YAC构建人类基因组文库，只需数千个重组体即可满足需要。例如，应用YAC技术构建了覆盖人类整个基因组的大片段DNA的YAC克隆片段重叠群，在此基础上再进行人基因组计划的大规模测序。
