盘绕螺旋结构的设计和优化技巧实验（三）
( 9 ) Ji 等突变了 gp41—— 来自猿猴免疫缺陷病毒的 6 螺旋束包膜蛋白，与 gp120 一起，负责病毒与 CD4+ 细胞的融合
[ 34 ] 。在结构上，它是由反平行杂二聚体组成的三聚体蛋白。在这一研究中，为核心氢键和盐桥负责的（两个 Gln 和两个 Thr 残基）4
个被掩埋的极性残基的每一个，都单独地突变为 lie。其中，3 个形成更稳定的 6 螺旋束，另 1 个形成不溶的聚集体（见注
10)。这些结果证明了这些残基具有控制结构稳定性和特异性间平衡的能力。这是非常重要的，因为在融合之前，此蛋白质要经受结构变化，并必须在两个结构之间有正确的稳定平衡，以使得这种变化是可能的。这些极性核心残基协助调控此构象稳定性，因而，也协助膜融合本身。
一般来说，核心
a 位的 Asn 残基对显然在二聚体中占支配地位，特别是，如果核心偏离最优的 Ile-Leu a-d
残基布置的时候，因为这一组合似乎导致平行二聚，而不需要核心内的 Asn 对。核心的 a 位 Gln
对三聚体可能是好的选择，尽管为了确保三聚体排它的特异性，可能还需要其他一些因素。
3.2.1.3 边沿残基
七元重复的
e 位和 g 位（边）在盘绕螺旋界面上从侧面围着 a 残基和 d 残基（图 3.1)。这些位置的掩埋，高度地取决于寡聚态。结果，在 e 位和 g
位氨基酸的选取可能受到寡聚态的影响。表 3.3 显示掩埋面积的百分数，表示在螺旋单独存在时的侧链可及表面积在寡聚态中变成掩埋状的分数 [16]
。
(
1 ) 与二聚体中对应位置相比较，三聚体的 e 位和 g 位富含疏水残基（lie、Leu、Val、Phe、Tyr 和 Trp )
并几乎没有特异的亲水残基（Glu、Gln、Ser 和 Arg；参考文献 [ 19 ]
)。这些模式是与三聚体中疏水界面相对于二聚体的扩张相符的。疏水残基百分数的增加使狭窄的疏水面的宽度增加，并且高寡聚态的似然率也增加了。在高寡聚态中有比两螺旋的盘绕螺旋更多的非极性掩埋。这可以从表
3.3 中看出。在 e 位和 g 位的疏水掩埋百分比，大约增加了 40%。三聚体中在对面带电的 gi 到 e'i+1 残基对（12% ) 相对于二聚体（23% ) 的减少与此相符 [19] 。
(
2 ) Fairman 等突变了 lac 阻遏蛋白的 C 端同四聚盘绕螺旋结构域，以产生杂四聚盘绕螺旋 [ 35 ] 。在 e 位和 g
位周边的 b 位和 c 位，全为 Lys 或全为 Glu 的多肽，结合力很弱。但是，把它们混合起来，就会形成高度稳定的四聚体（见注
11)。这证明了，至少对于四聚体，b 和 c 残基在盘绕螺旋的稳定性上也起了重要作用。这种作用类似于二聚盘绕螺旋中存在的 g/e'
离子相互作用，但四聚体加宽了的疏水界面扩展到这些残基，离子作用从核心幵始向外后退到 b 和 c 残基。通过改变 pH 和盐的水平，Glu 和
Lys
间的这些离子对相互作用，被证明为对稳定性的增加负责。另外，这些电荷在齐性寡聚时直接相对，并且很可能在潜在的齐二聚相互作用体中，这一不利的电荷排斥推动了杂二聚体的形成
[ 9，35 ]。
3.2.2 配对特异性
本节讨论配对特异性的重要性，以及盘绕螺旋可以用来保证没有其他能量上有利的结构可以被接受的某些方法。引人注目的是，与序列和结构上的相似性相反，盘绕螺旋偏向于与功能上的伙伴相互作用。本节分析介导这种高特异性的因素。
3.2.2.1 核心残基
如
3.2.1.1 小节所述，疏水残基（主要是 Leu、lie 和 Val )
分布模式是螺旋间结合的主要推动力。但是，因为这种模式非常常见，螺旋怎样能同时用其核心抗拒不同结构
的形成？答案是一个复杂的图像，包含微妙的变化，如非稳定化的、非疏水的核心残基的插入，这种变化会选择对抗另外种类的结构。
(
1 ) Sharma 等设计了一个多肽（anti- APCp1) ，其目的是用于结合来自腺瘤性结肠息肉（APC )
的肠癌有关肿瘤抑制蛋白的盘绕螺旋序列（见注 12；参考文献 [36])。 这样，他们采用了核心改变以及结合 g/e' 相互作用，而不是 Asn
配对，以证实特异性可归因于这个相互作用。他们推理认为，考虑到核心残基在结合过程中的主导作用，以及核心突变对稳定性和特异性都有大的影响，发现在主导特异性上对核心残基的低要求是令人奇怪的。为了处理这个问题，他们设计了
1 个多肽，以结合到 APC 的头 55 个氨基酸（APC55 ) 上，并基于角蛋白的类型 I 和类型 II 杂二聚体在位置 a 和 d
的共变模式，突变了此 anti- APCp1，以产生更常见的 a-a' 和 d-d' 配对。他们做了 3 个突变（在 a 层的 A41 I、d
层的 A2M 和 M44A )，以把野生型的 Ala-Ala 和 Met-Met 相互作用分别变为更常见的 Ala-lie、Ala-Met 和
Met-Ala 相互作用。两个更进一步的突变（a 层的 T6G 和 d 层的 N30H ) 用对应的 Gly-Gly 和 His-His
对来降低齐二聚体的稳定性。在定向抗 anti-APCp1 齐二聚化的同时，额外的 e-g'
配对优化了离子相互作用，所得二聚体具有稳定性及特异性。
(
2 ) Schnarr 和 Kennan 通过核心疏水残基的立体化学配合形成了杂三聚蛋白 [37] 。
在他们的研究中，用各种不同侧链长度的非天然氨基酸来启动特异的杂三聚体形成。 研究者们把 GCN4 核心 a 位残基用 Ala
或环己基丙氨酸替代（见注 13)，结果得到的是三聚体中立体化学不匹配的核心层，以 3 个 Ala 或 3
个环己基丙氨酸，产生立体规避或排斥。但是，2 个 Ala 和 1 个环己基丙氨酸产生了 1
个立体化学配合很好的杂三聚体。非天然侧链可以以这种方式产生盘绕螺旋。环己基丙氨酸的额外体积弥补了 Ala
核心层，以提供立体配合，而更大的侧链只会使分子不稳定。
3.2.2.2 极性核心残基
在 3.2.1.2 讨论了极性核心残基在引导螺旋特异的寡聚态上的作用。在 3.2.1.1 曾提到，在盘绕螺旋配对中的异型核心接触允许产生杂特异性。更多的特异性可通过极性核心与外沿残基的相互作用得到。
(
1 ) 在天然二聚盘绕螺旋中，a 位的 Lys 是仅次于 Asn 的最普通的掩埋极性残基 [19] 。A 位 Lys 可以与前 1
个七元重复的 e 位残基 [27] 形成螺旋内静电相互作用，以及与平行二聚体中，对面螺旋前 1 个七元重复的 g' 位的极性残基，形成螺旋间
g'-a 极性相互作用 [26]。
(
2 ) Campbell 和 Lumb 在肽拉链（PV) 的 Base-pLL 中放入了两个 a 位 Lys，以在肽拉链的 Acid-pLL
中实现螺旋间的由这 2 个 Lys 与 e' 和 g' 位的 Glu 残基提供的极性相互作用（见注 14；参考文献
[38])。正如所期待的，结果偏向于二聚态，很可能是因为在高寡聚态中会有较大的溶解损失。另外，这样的相互作用，相比于 Asn-Asn
(a-a') 相互作用，对稳定性的损害较小，主要是因为后者有较大的溶解损失需要付出。然而，平行和反平行的皆有可能，主要是因为，平行取向中的
a-g' 相互作用和反平行取向中的相互作用在能量上是相似的。
(
3 ) Harbury 的组采用计算方法 [ 见 3.2.5.4 (4)]，不仅考虑期望的结构，而且考虑不同的不期望的结构，以实现特异性
[39] 。改变了 GCN4 的中心七元重复的 a 位、d 位、e 位和 g 位残基（见注 15
)；所有非脯氨酸残基以及同型和异型序列都经受了计算选择和实验验证。次于 g/e' 残基对的体积互补和电荷互补，发现 d 位的 Glu 宁愿与
e' 位的 Arg 配对。
3.2.2.3 边缘残基
配对特异性受到
e 位和 g 位残基静电本质的影响（在平行二聚螺旋中，一个七元重复的 g 位与另一个螺旋的下一个七元重复的 e' 位，被记为 i→i’+5
)。这些残基常常分别是 Glu 和
Lys。这样互补的残基对相互作用，分别增加并巩固原来由核心疏水作用提供的特异性和稳定性。盘绕螺旋外接触边缘的电荷模式会指导蛋白质是形成齐聚还是杂聚蛋白，以及盘绕螺旋内的取向是平行的还是反平行的。但是，PV
假定（见第 1 节；参考文献 [ 8 ] )
过分地简单化；那些在复合物稳定性上很少有或没有作用的残基，通过指导螺旋避开，那些会危及分子的特异性的，同样的或不期望的相互作用来达到其目的（负设计）。另一方面，某些盘绕螺旋似乎没有经受到进化压力，因为它们已经是特异性的，并且也不需要比它们现在的状态更稳定。
( 1 ) 如所期待的，用排斥的 Glu-Gk 配对取代有利的 g/e' 位 Gin-Gin 配对已被证明使盘绕螺旋构象不稳定 [ 40]。
( 2 ) Hodges 及其同事估计 g/e' 配对盐桥对盘绕螺旋稳定性的贡献是 0.37 kcal/mol ( 见注 16；参考文献 [41])。
( 3 ) 细心 e 和 g 位电荷，可容许杂二聚体的生成，并另外保证，如 PV 假定所包含的，不倾向于生成齐二聚体[ 9，42，43] 。
(
4 ) 在 e 位和 g 位找到的 4 个最常见的氨基酸是 Glu、Gln、Arg 和 Lys。这些残基含有长疏水侧链，能够与 a 和 b
核心残基作用，并终止于一带电（Glu、Arg 或 Lys) 或极性（Gin) 基团。通过先突变 e，而后 g，最后两个七元重复对上的残基为
Ala，Krylov 等针对鸡的卵黄蛋白原结合蛋白成功地建立了这些相互接触残基的耦合能 ( 见注
17)。这一双突变热力学循环被用来为外沿残基接触的倾向建立热力学标度（表 3.4)。在 150 mmol 氯化钾和 pH 7.4
的条件下，Glu-Arg 吸引被证明比 Glu-Lys 吸引稍微稳定，合理的解释是，Arg
的侧链较长并较好地与谷氨酸相互作用，而且，各个甲基更有效地把核心与溶剂屏蔽开。这样的后果是增加带电末端基团的作用，在较弱的水性环境中产生较大的贡献。如所预期的，高盐像低
pH —样，弱化这些相互作用。在高盐或低 pH 条件下，极性作用减弱，疏水作用增强。Glu-Arg、Glu-Lys 和 Gin-Gin
相互作用是最具稳定能力的（与取向无关）。而 Glu-Glu、Arg-Arg、Arg-Lys、Lys-Arg 和 Lys-Lys
这些相同电荷的相互作用相当地不受欢迎。
