cDNA合成技术的基本步骤
(1)取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每RNA使用0.5ug引物(如使用Not I引物接头,用0.3ug),用H2O调整体积至15ul,70℃处理5min冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入:
5X第一链缓冲液5ul。
RNasinRNA酶抑制剂25U
M—MLV(H)反转录酶200U
H2O调至总体积25ul
(2)用手指轻弹管壁,吸取5ul至另一eppendorf管,加入2~5ulCi[α一32P]dCTPdCTP(>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
(3)37℃(随机引物)或42℃(其他引物)保温1h。
(4)取出置于冰上。
(5)掺入测定的eppendorf管加入95ul 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100ul。可取90ul进行电泳分析(先用苯酚抽提)。另10ul进行同位素掺入放射性活性测定。
(6)第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成。
以上25ul反应总体积中所用RNA量为1ug,如合成5ugRNA,则可按比例扩大反应体积。倒5ugRNA使用125uL总体积进行合成。
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