关于cDNA合成技术的介绍
以Riboclone M-MLV CDNA合成技术为例。
Riboclone M—MLV cDNA合成系统采用M—MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶I进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。其基本步骤为先合成第一链：
（1）取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每RNA使用0.5ug引物（如使用Not I引物接头,用0.3ug）,用H2O调整体积至15ul,70℃处理5min冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入：
5X第一链缓冲液5ul。
RNasinRNA酶抑制剂25U
M—MLV（H）反转录酶200U
H2O调至总体积25ul
（2）用手指轻弹管壁,吸取5ul至另一eppendorf管,加入2~5ulCi[α一32P]dCTPdCTP（>400Ci/mmol）,用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
（3）37℃（随机引物）或42℃（其他引物）保温1h。
（4）取出置于冰上。
（5）掺入测定的eppendorf管加入95ul 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100ul。可取90ul进行电泳分析（先用苯酚抽提）。另10ul进行同位素掺入放射性活性测定。
（6）第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成。
以上25ul反应总体积中所用RNA量为1ug,如合成5ugRNA,则可按比例扩大反应体积。倒5ugRNA使用125uL总体积进行合成。
推荐
