利用基于诱导多能干细胞的神经突生长测定法进行神经...
利用基于诱导多能干细胞的神经突生长测定法进行神经毒性和神经元发育的评估
介绍
对环境中未经检验的化学品日益普遍的关注已经产生了开发可靠和有效的筛选工具以识别可能影响人类健康的，特别是神经系统发育的化学物质的迫切需求。
我们评估了一种神经突向外生长的测定方法，通过筛选和表征所选化合物的活性，评估其是否可能对发育中的神经系统产生不利影响。选择该测定法是因为其在神经系统发育关键过程的模型具有一定相关性，特别是神经元会通过延伸其神经突以形成完整的神经网络。破坏这一过程可能会对人类和啮齿动物产生不利影响，因此研究表明，未成熟、发育中和成熟的神经突是化学毒性的靶标。
虽然神经突向外生长测定主要用于评估发育神经毒性，但也可用于评估通过检测神经突收缩的神经变性。此外，该测定还有可能与评估成年神经元中的神经可塑性相关。对于筛选测定，总神经突向外生长通常是指标报告中最常见的度量标准。利用自动成像还能够对其他特征进行多参数评估，例如总分支数和总过程数，以评估化合物可抑制神经突向外生长的不同方式。
材料
•ImageXpressNano自动成像系统，配备CellReporterXpress自动图像采集和分析软件(MolecularDevices)
•iCell®神经元(CellularDynamicsInternational)
•Poly-d-赖氨酸预包被384孔板(CorningLifeSciences)
•层粘连蛋白(Sigma-Aldrich)
•多聚甲醛(Sigma-Aldrich)
•胎牛血清(Sigma-Aldrich)
•β-微管蛋白III(TUJ-1)(BDBiosciences)
•Hoescht(ThermoFisherScientific)
•抗β-微管蛋白抗体(BDBiosciences)
•CalceinAM(ThermoFisherScientifiic)
利用基于iPS细胞的神经突生长测定法鉴定具有神经毒性的化合物
由国际细胞动力学会(CDI)提供的人iPSC衍生的神经元(即iCell神经元)细胞，是由有丝分裂后GABA活性基团和谷氨酸能神经元组成的混合物。这些研究中使用的神经元已经由制造商培养成完全分化和纯化的细胞群，并已形成对神经元标志物β-III微管蛋白和MAP28呈阳性的神经突网络。细胞收到时为冷冻状态，随后解冻并根据CDI推荐的方案铺板。将细胞接种在聚-d-赖氨酸预包被的384孔板上，并用3.3μg/mL层粘连蛋白进行处理。在化合物处理之前，每孔接种7,500个细胞，并在iCellNeurons培养基中生长48小时。这些细胞中的神经突网络通常在接种后约24小时开始形成，并且在培养至10-12天时开始增加复杂性。在接种后48小时，我们神经突向外生长进行评估，与此同时，神经元也可能发生神经突萎缩。在6种浓度范围(0.3,1.0,3.0,10.0,30.0和100μM)中一式两份测试化合物。每个平板中包括多个DMSO对照(n=16)和未处理的对照(n=16)。使用高达0.3％的DMSO来评估测定中的溶剂效应。将细胞在37℃和5％CO2下暴露于化合物下72小时。接着，除去培养基，用4％多聚甲醛固定细胞2小时。用含有1％胎牛血清和0.01％皂苷的PBS中的进行透化。随后，将细胞与抗β-微管蛋白III(TUJ-1)抗体(1:100稀释)和2μg/mLHoechst的结合AF488染料的小鼠抗人抗体孵育3小时。β-微管蛋白用作神经突向外生长的标记物，也用于完整神经元细胞体的计数。温育后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)替换染色溶液。或者，还可以使用活细胞进行神经毒性测定，用钙黄绿素AM和Hoechst染料(分别为0.5μM和2μM)染色30分钟。有关接种密度优化的详细信息和384孔格式测定的方案在Sirenkoetal.6中有详细描述。
使用ImageXpressNano自动成像系统的10倍PlanFluor物镜拍摄各孔的图像。在384孔板中的每个孔的单个位点捕获一个10x图像。10x物镜提供了足够的分辨率来区分每个图像中大量细胞(500-1,000)的神经突网络和亚细胞结构，能覆盖表总孔面积的约1/4。在获取图像之后，使用CellReporterXpress™自动图像采集和分析软件完成所有图像分析，该软件包含用于神经突向外生长和活力评估的图像处理应用模块。作为图像处理的示例，图1表示出了来自神经突图像和相应分析图层的放大的典型图像。图2显示来自DMSO处理的神经元和化合物处理的神经元的图像，在其相应结构上有软件追踪的覆盖图层。
图 1 ß-微管蛋白 ( 绿色 ) 染色的图像和对照细胞的软件分析轨迹。将 iCell 神经元铺板培养 5 天，然后 固定，并用 AF 488 结合的抗-β-微管蛋白 (TUJ-1) 抗体 (1:100) 染色。图像由 ImageXpress Nano 系统 使用 10x Plan Fluor 物镜和 FITC 通道拍摄。使用 CellReporterXpress 软件中的 Neurite Tracing 分析 算法处理图像。右侧的分析图层显示细胞生长 ( 绿色 ) 和细胞体 ( 蓝色 )
图 2 ß-微管蛋白 ( 绿色 ) 和 Hoechst ( 蓝色 ) 的复合图像，显示对照细胞和用所选化合物处理的细胞 的分析轨迹。将 iCell 神经元铺板 48 小时，用化合物处理 72 小时，然后固定并用 Hoechst (2 μM) 和 带 AF 488 荧光的抗 TUJ-1 抗体 (1:100) 进行组合染色。图像由 ImageXpress Nano 系统使用 10x Plan Fluor 物镜进行 DAPI 和 FITC 通道拍摄。使用 CellReporterXpress 软件中的 Neurite Tracing 分 析算法处理图像。观察到用指定化合物处理的神经元中破坏的神经突网络和细胞死亡。
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项目成果
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项目成果
