分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

磁珠深度解析，真的非AMPure XP不可吗？

2020.4.22

　　基因测序越来越得到临床的认可，尤其是精准医疗概念提出以后，更是备受青睐，为精准治疗解答很多未知的问题。高通量测序技术的跨越式发展，使测序能力大幅上升，在整个NGS工作流程中，磁珠是必不可少的产品。磁珠通过磁颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，将样本中目的片段分离。可实现对核酸样本的高通量自动化操作，广泛应用于基因测序以及分子诊断领域。

　　一、磁珠简述

　　1. 背景介绍

　　磁珠的发明构想最初来自于挪威科技大学的化学家John Ugelstad 。后期经过不断地创造与改善，目前我们zui常见的磁珠是纳米级别的磁珠，这类磁珠各式各样，根据其表面性质的不同，分离的原理也不尽相同，但其材料组成和基本的结构并无太大的差异。基础结构分为三层，最内层的是聚苯乙烯，第二层包裹磁性物质Fe3O4，最外层是修饰的官能团（如羧基）。其中官能团能与核酸结合，表面基团不同，下游的应用也不尽相同，如核酸提取，纯化，生物素捕获等。

　　图1. 磁珠结构示意图

　　2. 原理解读

　　商业化磁珠产品体系一般包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、盐离子等。在整个体系中，影响DNA回收的因素包括聚乙二醇（PEG）、DNA大小和浓度、孵育时间等，其中PEG是影响DNA回收的决定性因素。DNA在较高浓度的PEG和NaCl中脱去分子水化层，分子构象由线状被压缩成卷曲球状，并暴露出大量带负电荷的磷酸基团，带负电荷的磷酸基团与羧基在Na+的作用下形成“电桥”，使DNA被特异吸附到磁珠表面。当PEG和NaCl被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化DNA，解除三者间的离子作用，使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。此外，不同长度的DNA随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，可以被选择性的沉淀出来。

　　图2. 磁珠吸附DNA原理示意图

　　二、磁珠应用

　　磁珠凭借其高通量，适用于自动化的特点在高通量测序中备受推崇，并广泛用于NGS建库中DNA的提取、纯化和分选。

　　1. 核酸提取

　　磁珠法提取中的细胞裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物的细胞裂解，并使与核酸结合的蛋白质变性。核酸被游离释放，携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸，核酸与磁珠结合后，经过数次洗涤与磁场捕获，去除DNA/RNA以外的蛋白质、多糖等杂质，再用洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA/RNA，洗脱下来的核酸即可通过PCR 或其它特定方法来检测特定的DNA 或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业，且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。

　　图3. 磁珠核酸提取流程示意图

　　2. DNA纯化

　　DNA纯化的目的在于去除不想要的DNA片段。由于磁珠优先吸附大片段，因而可通过一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丢弃上清中的非目标片段，之后将磁珠吸附的目的DNA洗脱回收。常用于小片段如接头二聚体/引物二聚体的去除。此外还有一些客户会用于样本的富集。

　　图4. DNA纯化流程示意图

　　DNA样本经磁珠纯化后会有部分样本的损失，磁珠回收效率可评估磁珠的回收能力。通常可通过计算得出：回收效率=（纯化后的DNA质量/Input DNA质量）×100%。如下图数据所示：翊圣DNA磁珠批次间稳定性佳，回收效率与XP磁珠相当，可作为一款高性价比产品替换XP磁珠。

　　表1. 磁珠回收效率计算

　　平行

　　样本

　　Input（ng）

　　纯化（1.8×）

　　纯化后（ng）

　　回收率%

　　平均回收率

　　平行1

　　A-XP

　　169.5

　　153.25

　　90.41%

　　B-YS

　　159.75

　　94.25%

　　94.5%

　　C-YS

　　162

　　95.58%

　　D-YS

　　158.75

　　93.66%

　　平行2

　　A-XP

　　156

　　92.04%

　　B-YS

　　156.5

　　92.33%

　　93.51%

　　C-YS

　　160

　　94.4%

　　D-YS

　　159

　　93.81%

　　【注】：磁珠测试数据来源于上海某生物公司，表格中A为AMPure XP磁珠；B、C、D分别是翊圣磁珠三个不同批次。

　　3. DNA双轮分选（片筛）

　　由于二代测序段短读长的局限性，所以最终的NGS文库需满足一定的长度要求。片筛的目的在于从片段化DNA中选择特定区域的DNA片段，以满足上机需求。比如将样本中的片段分布比作下图中的正态分布，由于磁珠优先吸附大片段，所以第—轮磁珠吸附目的片段以上的大片段，此时弃磁珠留上清（目的片段在上清中）。第二轮磁珠吸附目的片段，此时弃上清，再将磁珠上的目的片段洗脱回收。

　　图5. DNA双轮分选流程示意图

　　分选精度则是评估不同的磁珠投入比例分选得到的片段大小。一般以Agilent 2100仪器检测。

　　在特定磁珠比例条件下，不同样本分选后片段分布范围集中在同一位置。较好的分选效果应该是顶部窄而圆润的独峰。此外不同厂家由于buffer的不同在特定磁珠比例条件下分布也会有一定的差异，使用前需根据各厂家相应的说明书确认目标片段的分选比例。如下数据所示：相同的分选比例，翊圣磁珠与进口XP磁珠，分选效果高度一致。

　　表2. 分选效率计算

　　样本

　　测试人

　　分选（0.65×/0.2×）

　　测试人

　　分选（0.65×/0.2×）

　　Input（ng）

　　分选后（ng）

　　回收效率%

　　平均回收率

　　Input（ng）

　　分选后（ng）

　　回收效率%

　　平均回收率

　　A-XP

　　测试人1

　　276.44

　　55.2

　　19.97%

　　测试人2

　　276.44

　　48.9

　　17.69%

　　B-YS

　　61.35

　　22.19%

　　22.84%

　　60.15

　　21.76%

　　21.31%

　　C-YS

　　65.4

　　23.68%

　　60.15

　　21.76%

　　D-YS

　　62.55

　　22.63%

　　56.4

　　20.4%

　　【注】：磁珠测试数据来源于上海某生物公司，表格中A为AMPure XP磁珠；B、C、D分别是翊圣磁珠三个不同批次。

　　三、产品信息

　　Hieff NGS® DNA Selection Beads基于SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization)原理，配合精心优化过的缓冲体系，可用于二代测序文库构建过程中的DNA片段分选、纯化。本产品可适用于各品牌的DNA、RNA建库试剂盒，和目前广泛使用的XP 磁珠使用方式相同，片段回收效率和文库大小分布均与 XP 磁珠高度吻合。但翊圣磁珠的价格zui低可以做到3元/库，与进口XP磁珠达到3倍之差！

　　表3. 2020翊圣磁珠价格

　　翊圣磁珠

　　规格

　　价格/元

　　Hieff NGS® DNA selection Beads

　　450ml/瓶

　　26186

　　促销价/元（即日至4月30日）

　　1~5瓶，13500/瓶

　　6~10瓶，12000/瓶

　　11~20瓶，9800/瓶

　　21~50瓶，8000/瓶