mESCs建系
实验概要
mESCs建系
主要试剂
细胞基础培养液、DPBS、0.25%Trypsin、0.1%明胶、兔抗鼠全血清原液、豚鼠补体、0.5%链蛋白酶、冲胚液、培养液A、mESCs培养液B
主要设备
35 mm、60 mm、100 mm培养皿、15 mL离心管、50 mL离心管、体视镜、注射器、镊子、虹膜剪
实验材料
小鼠（3.5 dpc），即见阴道栓后3.5天的怀孕小鼠
实验步骤
（1）胚胎的获得
①取怀孕3.5 dpc的孕鼠，用断颈法处死。
②用75%酒精消毒孕鼠，尽量喷湿全身。
③打开腹腔，用虹膜剪和镊子修剪去脂肪和系膜（用镊子将子宫轻轻拉起，使系膜和脂肪张开，然后用虹膜剪紧贴子宫将系膜与子宫分离），从输卵管根部及子宫下端分叉处剪下双侧子宫，将双角子宫于阴道处剪断。
！注意：冲胚时选择合适大小的镊子、剪刀，直镊、直剪。
④注射器吸入冲胚液CZB，配以剪平头的4＃至6＃针头，用镊子（最好是直头镊子）轻轻从一端（细端，即连接卵巢的一端）插入子宫腔内2～3
mm（注意，针头尖端很锐利，不要将子宫壁戳破），用镊子轻轻夹紧，吹入冲胚液（最后一滴若不滴下，可轻轻贴一下平皿侧壁使液滴进入平皿），再从另一端（粗端，即连接阴道的一端）插入，吹入冲胚液。
！注意：冲胚的针应事先剪成平头，灭菌，因为尖针头端很锐利，容易将子宫壁戳破。
⑤将盛有冲胚液的培养皿置于解剖镜下，用口控吸管（直径1.1～1.2
mm，末端直径约100
µm）吸取少量（充满毛细管尖端细管部分即可）细胞基础培养液（防止胚胎粘在毛细管壁上，无法吹出），用口控吸管将胚吸出。如果是早期囊胚或桑椹胚应该先在细胞基础培养液中培养过夜至晚期囊胚再进行处理。
（2）mESCs的建系
1）内细胞团接种法建系
（1）免疫外科法分离内细胞团
①去除透明带：将囊胚吹入0.5%链蛋白酶中，反复吹打囊胚，1-2分钟左右透明带逐渐变薄最终消失，立即将去除透明带的囊胚吸入冲胚液中，并反复吹洗。
②将胚胎移到CZB培养3 h，。
③将去除透明带的胚胎移入含兔抗小鼠IgG血清的DMEM培养液中（1:30），置于培养箱中处理30 min。
④将胚胎移入新鲜的豚鼠血清补体中处理胚胎10-15 min，溶解滋养层细胞。处理过程中，随时观察。当滋养层细胞膨大，呈透明空泡状即终止处理，用冲胚液洗涤3次，来回吹打去除滋养层细胞。
注意：将胚胎从兔抗鼠全血清原液移入豚鼠血清补体时，不用DPBS洗，直接放到补体中，处理效果较好；用DPBS洗后再放到补体中，处理效果不好。
⑤用冲胚液吹洗胚胎3次。
⑥将胚胎移回CZB滴中，培养24 h。
⑦如有需要重复第⑤～⑥步，重新用兔抗鼠抗体和豚鼠血清处理胚胎，去除残余的滋养层细胞。
⑧将去除滋养层细胞的内细胞团【受精卵发育为胚胎的过程中，随着细胞的分裂增殖依次经历卵裂期→桑椹胚→囊胚→原肠胚。细胞的分化则是从囊胚期开始的，在囊胚期，一部分个体较大的细胞聚集在胚胎（球形）一端，称为内细胞团，将来发育为胎儿的各种组织器官。】
（2）接种内细胞团并建系
（a）全内细胞团接种法
①将分离出来的内细胞团细胞移至mESCs培养液B培养液内，继续培养。
②培养48 h后，可见内细胞团生长，3～5天后内细胞团进一步增大，此时可以进行传代。
（b）消化接种法
①将内径0.5 mm，长100 mm玻璃管一端在火焰上灼烧、拉细，用砂轮将末端切断。准备末端口径比内细胞团稍大(约50µm)和稍小(约30µm)两种。
②用末端口径比内细胞团稍大的毛细管挑起内细胞团，吸至0.25%Trypsin消化液内，消化至3～4个细胞在一起的团块，加少许mESCs培养液B稀释0.25% Trypsin。
③将分散的内细胞团小块吸至准备好的饲养层上，在mESCs培养液B中培养。
④培养48 h后，可见胚胎干细胞小集落出现；3～4天，集落进一步增大；6～10天，可进行消化传代。
（2）全胚接种法建系
①冲胚过程见本章“胚胎的获得”部分
②将冲出的囊胚吹入提前一天接种了饲养层细胞的4孔培养板，换用mES培养液A或者B，每孔中放5～7个囊胚；
！注意：冲出的胚比较易于聚集在皿的边缘，需要小心
③放入培养箱中培养。囊胚逐渐长大，最后贴壁，滋胚层展开，ICM不断增殖。
！注意：胚胎接种到饲养层细胞上之后，前几天不要动4孔培养板，因为这个时候ICM还没有完全贴壁。
④培养4～6天后，ICM成为一团圆柱形细胞团（近似垂直于培养皿表面），将ICM进行消化传代；一般要培养6～7天，ICM才成为一团圆柱形细胞团，此时可以用机械切割的方法或者Trypsin消化的方法进行传代。此时将细胞的代次记为P1（即Passage 1）。成功建立的mESC系之后可以进行常规的传代、培养和冻存。mESCs细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞浆少，结构简单，细胞排列紧密，呈集落状生长，如图3-3所示。
！注意：机械切割传代时要彻底去掉杂细胞，尽可能少的带入滋养层细胞；一个圆柱形内细胞团放到一个孔里。
如果克圆柱形内细胞团完全从透明带孵化出来，可以用0.25%Trypsin消化传代，最好用含有1%鸡血清的0.25%Trypsin进行消化，消化过程中可在显微镜下观察，当细胞变得松散时即可用细胞基础培养液终止消化。
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