原位杂交组织化学实验技术4
二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用
（一）光敏生物素标记cRNA探针的应用
以线性质粒DNA为模板合成未加标记物的cRNA探针，使其最终浓度为0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再与等体积的光敏生物素（1μg/μl）混合。在150瓦卤素灯下，距离光源20cm处照射30min。用仲丁醇抽提游离生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探针，将其溶于适量的灭菌双蒸水，用紫外分光光度计测探针的光密度（详第十九章 ），其最佳工作浓度为2μg/ml。
切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节 。
光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序：
（1）石蜡切片脱蜡入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min；冰冻切片直接入PBS冲洗5min。
（2）0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。
（3）0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。
（4）蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配）37℃保温30min。
（5）4%多聚甲醛PBS固定5min。
（6）0.1mol/l PBS冲洗2×3min。
（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
（8）2×SSC冲洗10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠）。
（9）取10μl含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探针则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上放入冰浴中冷却，然后再用。
（10）盖上22×22mm的硅化盖片或合适大小的蜡膜，入温盒43℃保温12～16h。
（11）4×SSC洗脱盖片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。
（12）2×SSC（含20μg/mlRNaseA, 适于RNA探针）冲洗30min，37℃。
（13）1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。
（14）0.05mol/l PBS 冲洗4×5min。
（15）3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配）37℃保温30min。
（16）Avidin –AKP(碱性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS配）室温1～3h。
（17）0.05mol/l PBS冲洗4×5min。
（18）TSM1冲洗2×5min。
（19）TSM2冲洗2×5min。
（20）硝基四氮唑蓝（NBT）0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）0.2mg/ml混合液显色，室温，暗处3h。
（21）20mmol/l EDTA,pH8.0终止显色。
（22）甘油明胶直接封片。
结果：杂交阳性部位着蓝黑色。
组织处理及预杂交所用器皿需高温消毒，实验者需戴手套。
（二）酶促生物素标记cRNA探针的应用
基本方法和放射性标记cRNA探针同，所不同的是探针浓度为2.5μg/μl。显示探针反应步骤如下。
（1）用PBS冲洗粘附有切片的载片2×3min。根据情况也可用漂洗法。
（2）将载片浸入0.3%H2O2在PBS或甲醇内30min以封闭内源性过氧化物酶。
（3）PBS冲洗2×3min，用吸水纸拭干切片周围的水份，加入小鼠抗生物素血清1：100和PBS含正常羊血清（1：30），室温1h，或4℃过夜。
（4）PBS彻底冲洗。
（5）载片加生物素化抗小鼠IgG（1：100）30min室温。
（6）PBS彻底冲洗。
（7）应用ABC复合物与等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h，室温。
（8）PBS彻底冲洗。
（9）将切片覆以新鲜配制的0.025%DAB溶液，0.02%H2O2,孵育3～15min。
（10）水洗，复染，脱水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用银染，多层ABC或PAP法加强染色效果。
三、地高辛标记cRNA探针的应用
（一）基本原理
地高辛（Digoxigenin 简写Digo-）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成digoxigenin –11-dUTP（图20-3）。通过随机引物或缺口翻译法（多用随机引物法），将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体Tab（抗原结合片段）结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的，其反应过程见图20-3。
图20-3 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应
常用的免疫酶学检测方法有两类：一是Dig –HRP（辣根过氧化物酶）检测体系，以DAB（四氢氯化二氨基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。另一是Dig –AKP检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。
应用地高辛标记的核酸探针也较稳定，据报告在-20℃贮存可达2年，随时要取用，不像放射性标记探针有半衰期所致的时间限制。但在现实应用中，仍喜欢采用新鲜的地高辛配基标记3～6个月以内的核酸探针。为节 省核酸探针的用量，凡使用过的含有探针的杂交液也可反复多次使用，特别是对于已知的重复性实验。对于细胞或组织内未知mRNA的检测，仍宜采用未使用过的探针杂交液为佳。
与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。由于地高辛具有灵敏度及分辨率高，反应产物颜色鲜艳，反差好，背景染色低，制备探针可较长期保存，对人体无害等优点，已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。它不仅可应用于原位杂交细胞化学，还可应用于Southern印迹杂交法检测特定基因组序列，进行RFLP分析用于基因诊断，菌落原位杂交，噬菌斑原位杂交，固定细胞及中期染色体原位杂交以及生物体液中，组织中病毒DNA序列的检测。这一技术还被应用于检测DNA标记物及测序，对人类染色体连锁图谱进行构建和基因图谱分析。
（二）基本操作步骤
组织处理及预杂交等步骤与本章 中叙述的放射性同位素标记cRNA探针相同，但由于地高辛标记cRNA探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用，我们在基本方法中仍较详细的叙述其操作过程。
1．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10～30μm）最佳。切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37℃预干燥4h，然后置于37℃烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37℃烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。
在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸（foilpaper）包被，内加少许干燥剂（变色硅胶）。
下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
（1）PBS洗2×3min。
（2）选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。
其它切片暂放于PBs 内。
RNA酶对照片处理方法：加RNA酶（100μg/ml）在预热37℃的溶液内。放在潮湿的盛有少许2×SSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗，2×3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。
（3）蛋白酶K消化：将组织切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，内含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。
（4）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
（5）在4%多聚甲醛/PBS3min。
（6）以PBs 漂洗2×3min。
（7）浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封闭非特异性结合部位。
（8）2×SSC漂洗15min。
2．杂交以含cRNA探针（0.5ng/ml）的杂交液，按每张切片10～2μl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2×SSC温盒内在42℃，16～18h或过夜。
3．显示
（1）用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。
（2）在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。
（3）拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清（工作浓度1：500，以缓冲液1稀释），孵育2h，室温。
（4）缓冲液1漂洗3×3min。
（5）浸入缓冲液210min室温。
（6）浸入底物中孵育10～30min（或更长时间，视需要而定），底物内含显色BCIP/NBT，室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。
（7）将切片浸入缓冲液3以终止反应。
（8）复染，可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁（又称派咯宁丫）（pyronin 丫）10～30s。
（9）流水洗5～10min，直至水无色为止。
（10）在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX封固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。
几点说明
①缓冲液1，2，3配制法见附录。缓冲液1中BSA用量大，价贵，如无法负担可略去。
②切片处理过程可采取漂浮法或载片染色法，载片染色适用于切片数数量较少时，可用液体覆盖于切片表面进行孵育，漂洗在烧杯内进行。如切片多，可将载片置于方形的染色缸（staining jar）内，将冲洗液加入缸内，如有振荡器在漂洗中稍加震荡更有助于减低背景染色。漂浮法适用于切片数量大量，将切片置于凹形碟内，或染色缸内。漂浮法的优点是节 约试剂用量，切片两面均可接触反应液，有利于信号的增强。
③在底物中孵育时间过长会产生弱强的非特异性染色，有时甚至误为阳性反应。解决方法一是设置对照片，二是对非特异性染色加以区别。非特异性染色与特异性染色的主要区别点在于后者有结构性定位，而前者系无结构性定位，常在切片边缘或细胞密集处呈现较强的颜色反应。
④在组织前处理中应严格注意控制RNA酶的污染，包括戴手套、器皿消毒等。另外，和免疫细胞化学一样，自始至终应保持切片的湿润，勿令其干燥。
第三节 DNA及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学中的应用
一、DNA探针的应用
虽然一般认为DNA探针敏感度不如cRNA探针，但在病毒的检测等领域中DNA探针仍得到广泛的应用。
在原位杂交细胞化学的操作步骤方面与cRNA探针基本相同，所不同的是：（1）杂交时需先在高温80～95℃短时处理，使DNA探针及细胞内靶DNA变性，解离成单链，迅置于冰上冷却。然后置于37℃～42℃杂交过夜。（2）RNA酶的溶液的冲洗不能减低背景，因此，在操作步骤中省略此步。
（一）地高辛-碱性磷酸酶（Dig -AKP）标记DNA探针在石蜡包埋切片检测病毒DNA中的应用
1．组织前处理
（1）固定：组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更紧贴玻片。
（2）脱蜡：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/l MgCl2,pH7.3～7.4）10min×2。入0.2n HCl 20min以进一步去除蛋白。
（3）50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。
（4）蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，）37℃20～25min。
（5）0.2mol/l 甘氨酸液：室温10min，中止蛋白酶反应。
（6）4%多聚甲醛（PBS新鲜配制）：室温20min。
（7）PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。
（8）脱水，自低浓度到高浓度，无水乙醇各3min，空气干燥。
2．预杂交封闭非特异性杂交位点，20μl/每张切片，42℃水浴半小时。
3．杂交10～20μl/每张切片，加盖硅化盖玻片，将切片置于95℃min，使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上1min（也有报告用乙醇使之冷却的），然后将切片置于盛有2×SSC湿盒内，42℃过夜（16～18h）。
4．杂交后漂洗
（1）2×SSC液内振动移除盖片。
（2）2×SSc 55℃10min×2。
（3）0.5×SSc 55℃5min×2。
（4）缓冲液II（含0.5%封阻试剂，用缓冲液I溶解）37℃30min。
（5）缓冲液I（10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5）15min，室温。
（6）酶标地高辛抗体（1：5000，应用缓冲液I稀释）37℃30min。
（7）缓冲液i 15min×2室温。
（8）缓冲液III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5）室温2min。
5．显色
（1）显色液配制：缓冲液III：1ml中加入4.5μl四氮唑蓝（NBT），3.5μl X-磷酸盐（5-溴-4-氯-3吲哚磷酸盐（BCIP配成））。30μl/每张切片，置暗处显色30min到2h。定时抽查切片，镜检其显色情况。
