人腺病毒7型呼吸道感染与实验室检查
近几年来，全球范围内由人腺病毒(human adenovirus，HADV)引起呼吸道感染的公共卫生事件时有新发和暴发[1,2,3]。尤其在亚洲地区人腺病毒7型(human adenovirus type 7，HADV-7)疫情的突发和频发引起的更长住院时间和更严重呼吸道感染，给社区、学校和军营等地的生活和工作带来了很大的干扰[4,5]。本文拟将HADV-7相关进展及实验室检查作一述评，为防控HADV-7疫情发生及提高实验室诊断水平提供参考。
一、生物学特性及分型
HADV-7为腺病毒科(Adenoviridae)的哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)B群成员之一，HADV是一种无包膜呈20面体对称的线性双链DNA病毒，病毒颗粒直径65～80 nm，由蛋白衣壳、核心蛋白和DNA组成[6]。衣壳含有240个六邻体、12个五邻体及12根纤突，六邻体含血清型特异的抗原决定簇，五邻体和纤突球部可与细胞表面的病毒受体结合，纤突球部有HADV组别和型别的抗原表位，纤突的长度和弯曲度则与血清型有关[6]。
2011年国际病毒分类委员会ADV小组规定：血清学是用于识别新型HADV的唯一依据[7]。但也指出了编码六邻体和纤突蛋白的核酸序列可用于HADV血清型间基因差异分析和分型。HADV血清型中，HADV-1至HADV-51是基于血清学方法鉴定和分型的，从HADV-52开始则采用了全基因组测序及进化分析来确定HADV型别，并成为判定新型腺病毒的基本方法[8]。
二、流行病学
迄今为止已发现HADV 7个群(A～G)共70个左右血清型(http：//hadvwg.gmu.edu)。据报道：HADV呼吸道感染率在成人和儿童中分别占第2和第5位，而HADV-7在HADV呼吸道感染中均居前列[9]；新加坡和中国台湾HADV-7感染率在逐年增加，重庆HADV-7呼吸道感染则占HADV呼吸道感染的50%左右[10,11,12]。HADV-7引起的暴发疫情已成为HADV呼吸道感染的主要流行病毒株和影响社会公共卫生的重要传染病之一[1,4,13]。我们从GenBank等网站收集已报道的66次HADV-7疫情的六邻体基因序列(>800 bp)，以最大似然法构建进化树，采用迭代法在PAUP4.0和migraphyla 1 B软件上进行HADV-7型的迁徙分析[13]：全球HADV-7起源于1953年加利福利亚报道的疫情分离株，并由此共引发21条主要(P<0.05)和5条次要迁徙传播路径(P＝0.055～0.068)，其中60%左右分布于亚洲。通过对全球HADV-7疫情的流行病学和迁徙分析，不仅丰富了分子生物学数据库，还提供了HADV-7预防与控制策略的依据。
三、临床诊断与鉴别诊断
HADV-7型引起急性呼吸道感染疫情，首发病例(易感者)一般有到过人群密集区域等接触史，潜伏期4～5 d，然后以发热、咳嗽、咽痛为主要症状发病并迅速传播扩散，部分病例发展为肺炎(儿童高于成人)，在采取有效措施隔离控制情况下，通常在1周左右达发病高峰，持续7～10 d左右无新增病例，1个月左右疫情得到控制并解除[14]。免疫功能正常的患者，HADV-7感染为自限性，2～3周症状缓解消失或通过隔离治疗痊愈，并产生特异性免疫。
HADV-7呼吸道感染者白细胞总数正常或稍减低，淋巴细胞相对增高，C-反应蛋白大多增高(>70%)，合并肺炎者，X线或CT胸片单侧或双侧有片状浸润，可有少量胸腔积液[13]。
HADV-7感染的临床诊断除根据流行病学及临床表现外，主要依靠实验室的病原学特异性指标来确诊。若HADV-7呼吸道感染者为散发病例，应与呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、流感病毒等常见呼吸道病原体感染相鉴别。若HADV-7呼吸道感染者为暴发病例，则应与高致性禽流感病毒及其他型别HADV等引起的急性呼吸道感染相鉴别。
四、实验室检查
(一)分离培养
采集患者咽喉部分泌物标本，经预处理后离心取上清接种敏感细胞(Graham293，A549，Hep-2或HeLa细胞等)，37 ℃培养5～7 d后可观察到细胞肿胀变圆、聚集呈葡萄串状的典型细胞病变，电镜下胞浆和胞核中可见大量典型的腺病毒颗粒[15]。腺病毒分离培养一般用于血清学鉴定与分型等流行病学和临床基础医学研究。
(二)血清学鉴定与分型
用荧光标记的抗六邻体抗体来鉴定腺病毒，也可用传统的血清学分型方法检测属和组特异性抗原并鉴定血清型[6]。血清学方法因其简便、快捷、价格低廉，在鉴定已有血清型别上具有优势。
(三)全基因组测序和进化分析分型
中和试验和血凝抑制试验对腺病毒进行鉴定时会出现不一致的结果(http：//hadvwg.gmu.edu)，甚至错误的型别判定[16]，故常通过扩增六邻体基因高变区核酸序列进行腺病毒鉴定和分型，且逐步成为主要的分型方法[8,13]。全基因组测序和进化分析分型将成为腺病毒鉴定与分型的"金标准"。
(四)巢式多重PCR扩增分型
根据HADV编码区核酸序列设计1对通用扩增引物，用于第1次PCR扩增，然后设计HADV不同型的特异性多对内引物，用于第2次PCR扩增，对第2次扩增产物进行实时荧光或电泳分型鉴定；有的直接采用通用引物进行实时荧光PCR检测HADV或与其他病原体组合建立多重PCR检测方法。此类方法操作简便、快速、灵敏特异，且有注册商品试剂盒供应，是临床实验室不错的选择[17,18]。
(五)环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)
LAMP是近几年来发展起来的一种核酸扩增技术，在60～65 ℃恒温条件下30～90 min即可完成扩增反应，肉眼即可观察结果。该方法既克服了传统PCR方法的不足，又具有直观、灵敏、特异、重复性好、不易污染和易于操作等特点[19]。
(六)抗原检测
直接免疫荧光法(direct immunofluorescence assay，DFA)：取咽部脱落细胞或分离培养的细胞涂片，用荧光标记的多价腺病毒免疫血清或特异性六邻体单克隆抗体染色，在荧光显微镜下可见脱落细胞或分离培养的细胞核内有明亮荧光即为阳性[20]。该方法是早期诊断呼吸道腺病毒感染的快速检测技术，一般与其他常见呼吸道病原体组合成4项或7项等抗原DFA检测试剂盒(已有注册商品试剂盒供应)，但受采样部位及采样量的影响较大，与核酸方法相比，符合率偏低(60%～80%)，故应重视规范化采样，阴性结果不能排除感染，且不能用于分型。
(七)抗体检测(血清学检测)
1．ELISA法检测双份血清IgG抗体：
采集急性期及恢复期双份血清，测补体结合抗体、中和抗体与血凝抑制抗体(IgG)，若有4倍增长可确诊HADV急性感染[15]。该方法仅用于临床呼吸道腺病毒感染的回顾性诊断及流行病学调查。
2．ELISA或间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)：
除了单个检测HADV IgM试剂盒外，多数与其他病原体(如肺炎支原体等)组合成5～9项病原体ELISA或IFA法联合检测IgM试剂盒用于病原体感染的早期筛查(已有注册的商品试剂盒)[20]。该技术因操作简便且实用而得到了广泛普及和应用。但应注意感染病程对诊断灵敏度的影响[20]。另外免疫力低下的儿童和老人可出现阴性结果。
3．免疫层析技术：
主要用于检测血清中IgM/IgG抗体的床边快速诊断与筛查[21]，阳性结果需结合临床症状综合分析，抗体含量偏低或免疫力低下者，可能显示阴性结果。
(八)其他方法
主要有限制性片段长度多态性分析技术、原位杂交技术、多重逆转录PCR基因芯片技术等，目前还处于实验室研究和开发阶段[22]。
五、结语
HADV-7是全球常见的导致呼吸道感染疫情暴发的病原体之一，我国亦有多起HADV-7在军营、学校及社区的流行与暴发记录。为有效保护易感人群，我国需尽早开发人腺病毒疫苗作为主动预防手段。HADV-7感染的诊断主要依赖于实验室检查结果，故应重视对HADV-7的检测。随着HADV血清分型和基因分型的手段不断发展和完善，分子生物学技术有取代传统血清学方法的趋势，这对HADV-7的流行病学监测、变异毒株的检出、临床治疗效果的评价和了解HADV-7的致病性都有重要意义。
