周界文/吴皓/陈枢青合作组发现死亡受体DR5信号传递机制
TNFR超家族（Tumor Necrosis Factor receptor superfamily, TNFRSF）在细胞凋亡和炎症等过程中发挥重要作用，同时也参与细胞增殖和细胞分化。大部分TNFRSF成员分布于免疫细胞，负责调控免疫细胞活性，比如4-1BB (CD137)、OX40、BCMA、CD27等，从而成为肿瘤免疫治疗的热门靶点；还有部分TNFRSF成员在肿瘤细胞上高表达，成为肿瘤治疗的理想靶点之一，比如DR4、DR5等【1】。因此，TNFRSF在肿瘤免疫抗体治疗和细胞治疗领域显得越发重要。
TNFRSF成员绝大多数为结构特征相似的I型单次跨膜蛋白，包含了富含半胱氨酸结构域（Cysteine-Rich Domain, CRD）的胞外区 (Extracellular domain, ECD)、跨膜区 （Transmembrane domain, TMD）和胞内区。TNFRSF成员死亡受体5（Death Receptor, DR5）是极具潜力的抗肿瘤药物靶点，它在多种肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中表达量相对较低，且可在被激活后诱导细胞凋亡。DR5的配体TRAIL（TNF-related Apoptosis-inducing ligand, 肿瘤坏死因子凋亡诱导配体）和激动型单克隆抗体因此成为理想的靶向广谱抗肿瘤蛋白药物。然而，DR5与其他的TNFRSF成员一样，其激活机制在领域内未有共识，目前较为主流的学说为DR5 ECD同时负责与TRAIL三聚体结合和后续的聚簇（clustering），DR5胞内的死亡结构域（Death domain, DD）起到协同聚集作用，促进DR5 clustering，从而快速传递、放大细胞凋亡信号，DR5 TMD则通常被认为仅仅起到锚定（anchor）在细胞膜上的作用【2】。
2月28日，来自哈佛医学院的James Chou（周界文）课题组、Hao Wu（吴皓）课题组与浙江大学陈枢青课题组合作在Cell在线发表了题为Higher-Order Clustering of the Transmembrane Anchor of DR5 Drives Signaling的研究论文，首次揭示了DR5在激活后其TMD聚簇（clustering），从而直接激活下游的细胞凋亡通路，而DR5 ECD则在DR5激活前起到自我抑制（auto-inhibition）作用，抑制DR5 TMD的self-clustering，防止DR5受体自动激活【3】。该研究成功解释了部分二聚（dimeric）的抗体或单体（monomeric）的抗体片段为何能够像三聚体的DR5配体（TRAIL）那样激活DR5，而且其中某些DR5上的抗体表位（epitope）与TRAIL在DR5上的结合位点完全不同。此外，TNFRSF包含了许多重要的免疫受体，比如TNFR2、OX40等，它们的TMD与DR5 TMD相似，均拥有GXXXG motif，可促进TMD clustering。因此，该研究提出了全新的TNFR家族受体的信号传递机制，同时也揭示了，单次跨膜区域在受体信号传递过程中可起到重要作用，是不能被忽略的区域。
该研究通过液相核磁共振、多肽同位素标记等技术单独对DR5 TMD在lipid bilayer（Bicelle技术）环境中进行深入研究，作者意外发现DR5 TMD单体含有两个作用界面（interface），意味着DR5 TMD在没有外界阻力的情况下倾向于高度聚集（聚簇）。DR5 TMD上存在多个三聚体（trimer）interface关键氨基酸位点：T219/V218、A222/V223、I226/L225，以及两个二聚体（dimer）interface关键氨基酸位点：G213、G217（GXXXG motif）。该研究利用活细胞成像、细胞生物学等技术证实，突变trimer 或者dimer interface关键氨基酸位点可显著影响DR5在细胞膜 上的cluster形成以及凋亡信号传递，表明TMD clustering是DR5受体的信号传递的必要条件之一。
该研究随后利用TEV酶巧妙地原位切除活细胞上的DR5 ECD，发现DR5 TMD可随即形成cluster（激光共聚焦显微镜证实），进而激活下游caspase级联反应，传递细胞凋亡信号，表明TMD clustering可直接驱动凋亡信号传递，且该过程被DR5 ECD（或Pre-ligand Assembly Domain, PLAD）所抑制。该研究首次展现了DR5受体跨膜区高度聚集的特性和分子机制，及其在信号传递中的重要作用，进而提出了DR5激活的新机制，为DR5激动型靶向抗肿瘤抗体药物的筛选提供了思路和理论指导。
图注：DR5跨膜区(TMD)在DR5激活后凋亡信号传递过程中聚簇（clustering）及其分子机制
该研究还发现TNFR家族的其他重要免疫受体也存在TMD clustering，通过酶切方式原位切除TNFR2和OX40 ECD均可激活下游NF-κB通路，表明TMD clustering在TNFR家族受体中是一种较为普遍的信号传递调控机制，且有望推导至其他受体的信号传递过程。因此，该研究展现了利用免疫受体胞外区的PLAD（Pre-ligand Assembly Domain）作为可溶性抗原高效筛选免疫受体激动型（agonistic）单克隆抗体的可能性；TMD clustering机制也为多特异性抗体高度激活（通过促进免疫受体的clustering）、调控免疫受体提供了新的思路和理论支持，因此有望推动基于新型抗体的免疫治疗。
据悉，James Chou教授、Hao Wu教授和陈枢青教授为本文共同通讯作者。本文第一作者为潘利强博士，曾在陈枢青教授课题组开展基于DR5配体TRAIL的新型靶向抗肿瘤药物设计和机制研究，后来在哈佛医学院做博后时进行了对DR5结构与机制的进一步深入研究。其他共同第一作者为哈佛医学院Tianmin Fu博士、赵琳琳博士和浙江大学博士生赵文彬。此课题里关键的核磁共振数据是在中国张江实验室国家蛋白质设施（上海）和美国MIT/Harvard 核磁中心采集的。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.02.001
参考文献
1. Ashkenazi, A., and Dixit, V.M. (1998). Death receptors: signaling and modulation. Science 281,1305-1308.
2. Vanamee, E.S., and Faustman, D.L. (2018). Structural principles of tumor necrosis factor superfamily signaling. Sci Signal 11.
3. Pan L, Fu T-M, Zhao W, Zhao L, Chen W, Qiu C, Liu W, Liu Z, Piai A, Fu Q, Chen S*, Wu H*, and Chou JJ*. (2019). Higher-Order Clustering of the Transmembrane Anchor of DR5 Drives Signaling. Cell, in press.
