FDA和NIST对细胞治疗中的细胞计数
近年来，由于细胞治疗方法的兴起，人们日益需求能够高质量、稳健、有效进行细胞表征测定的方法。细胞计数，作为细胞疗法中最基础的检测项目，现今需要更高的检测可信度。2017年4月，美国国家标准与技术研究院（NIST）&食品与药物管理局（FDA）共同举办了一场专注于细胞计数的研讨会，聚焦于选择、设计和验证细胞计数方法，以及如何得到充分的计量保证。近50位来自于工业界、学术界和政府监管机构的专家参与了研讨会。Nexcelom Bioscience作为为数不多的受邀细胞计数设备制造商之一列席参加了本次会议，与业界专家们共同讨论细胞治疗中关于细胞计数的各种问题。本文总结了此次会议的讨论重点。
研讨会的总体主题：我们需要根据细胞样品的属性，细胞计数的目的和要求，来选择适合目的（fit-for purpose）的测量方法。例如，药物筛选和细胞治疗产品生产与放行过程中的细胞计数要求会有显著不同。Fit-for purpose是指选择的方法是否适合细胞计数的预期目的。理想的适用性需要满足两方面的要求，一是能解决生物学问题，二是获得的数据质量（灵敏度、精密度、准确度）足够好，足以支持下游决策。一个更标准化的设计、限定和验证符合fit-for purpose原则的细胞计数方法的流程，将加速产品的开发和转化。
研讨会上讨论的主要内容：
细胞计数测量过程
细胞计数遵循相同的常规步骤：（i）样品准备，（ii）手工计数或使用仪器设备的自动计数，（iii）数据分析（如图1）。
Figure 1. General cell counting measurement process (Adapted from Lin-Gibson et al. Bioinsights, 2016).
测量过程中的很多方面都可能给结果带来显著的可变性。此外作为测量过程中“输入”的细胞样品，属性可能会有大范围的波动，也会给计数结果带来显著的可变性。细胞样品本身就很复杂，具有一系列稳定或者变化的性质 - 样品配方（如培养基组分）、成分（如不同细胞类型和功能）和固有的生物学可变性（如供体变化和细胞状态）。认识到细胞计数过程和细胞样品相关的各种影响因素，研讨会上专家们讨论了提高细胞计数可信度的策略。
从监管角度看细胞计数
Figure 2. Analytical method development flow diagram through stages of
cell-based product development and regulatory approval. For the purpose
of this figure, the following definitions apply: assay qualification,
determining if an assay is suitable for its intended purpose; assay
validation, assuring that the assay is suitable to its intended purpose
on a routine basis. (Courtesy of Steven Bauer, FDA)
FDA的与会人员强调了细胞计数对于检测细胞治疗产品质量（如属性、纯度、效价和剂量）的重要性。他们重申基于不同目的，最适合的细胞计数方法可能不同，这主要取决于细胞治疗产品本身。他们进一步指出，虽然在获得许可证之前，细胞计数等试验方法不需要进行验证；但越早建立高可信度的方法，越有利于产品转化（图2）。FDA与会人员特别指出：确定适当的细胞计数方法，了解可用的仪器，有助于共识性文件标准的制定和参考样品的开发，有利于解决再生医学疗法中细胞计数方面的挑战。
建立细胞计数方面的质量属性
细胞治疗产品的质量属性可通过测定相关的、可测量的生物学指标来评估。许多质量属性直接（如总细胞浓度、活细胞浓度）或间接（如使用细胞浓度归一化处理的活力数据）使用细胞计数结果获得数据。选择细胞计数方法时，要明确理解测量对象和预期质量属性之间的关系（如活细胞浓度、存活率百分比）。
例如活细胞浓度是一种差异细胞计数，需要将活细胞与死细胞区分开，与细胞类型无关。活细胞浓度又可以进一步分解成两个属性组成：活细胞数和样品体积。
测定活细胞数时，很多生物学指标可以用来区分活细胞和死细胞。这些生物学指标包括细胞膜完整性、代谢活力和细胞复制能力。生物学指标可以通过不同测试方法测定，且每种测试方法都有不同的测量对象。例如台盼蓝排除和DAPI核酸染色法都可以通过测试细胞膜完整性来区分活细胞和死细胞。对同一个生物学指标的类似检测，不同染料（大小、亲和力不同）对细胞膜渗透性的固有不同和显示信号（比色或者荧光）的不同，也会导致结果上的差异。
另一个属性组成是样品的体积。体积可以通过校准过的仪器来获得（例如已测定的计数室尺寸）：间接方法如同时用基于流式原理的方法测定已知浓度的微珠；或者通过流量计等方法直接测定。体积测定偏差将导致结果偏差，降低活细胞浓度测定结果精密度。另外在测试活细胞浓度时，仪器与仪器之间结果的差异，有些情况下可能是因为仪器体积校准之间的差异造成的。
总的来说，应选择反映预期测量目的的生物学指标；当应用这些生物学指标时，能够反映细胞治疗产品的作用机理。此外，测量目标应尽可能与生物学指标直接相关。专家强调需要了解细胞计数的生物学基础，特别是当某个细胞亚群被认为与生物学或临床结果相关时的差异细胞计数。
选择与设计细胞计数方法
自18世纪以来，使用血球计数板进行手工计数一直被认为是细胞计数的金标准。研讨会的参会人员表示这种观点现在依然存在。手工计数非常费时，并且误差很大，会给产品开发和生产带来很多问题。随着技术的发展，现在许多基于自动成像和流式原理的方法被用来进行总细胞和亚细胞群计数。可选的方法很多，样品类型以及细胞计数目的也各不相同。
细胞计数检测过程的考虑因素大致上可以分为：（i）生物学相关因素；（ii）测量特性相关因素，包括计量保证策略；（iii）合规性及其他实际因素。生物学相关因素是指计数方法基于生物学指标获得细胞数量的能力。分析方法的测量特性相关因素包括计数方法提供足够特异、精密和稳健数据的能力；控制测量过程中的可变性并确保过程中的可信度的能力也是需要的；另一个需要重点考虑的因素是方法在产品研发管线各个环节中的转化能力。理想情况下，研发过程中使用的细胞计数方法应该能够应用到生产甚至放行中。细胞计数系统需要尽量少的可变因素和校准要求，最好内置自控系统。紧接下来需要考虑的就是合规性，包括是否满足GMP （Good Manufacturing Practice）要求。如果不止使用一种计数方法，或者在不同地点使用同一种方法，需要考虑方法之间的可比性。其他需要考虑的实际因素包括：用量、价格、所需时间以及培训。一个特别需要指出的挑战是计数方法能够允许使用者自行修改调整的程度。仪器提供越多的微调设置，将提供更大的灵活性和可优化性；另一方面，增加仪器的灵活性意味着需要更多的培训，以及在生产中做更多记录。
实验设计（DOE）在优化细胞计数流程中的应用
一旦细胞计数的目的和大致方法已经确定，建议使用“实验设计（Design of Experiments ，DOE）来进行方法优化和稳健性测试。
专家指出很多因素影响了细胞计数实验。这些因素包括准备细胞样品时使用的稀释液。稀释液可能影响样品的稳定性，引入或者减少影响计数的碎片或杂质。仪器与仪器之间的差异也是一个挑战，需要使用更稳健的体积校准策略来改进，例如使用已知浓度的微珠或其他体积校准方法。很多因素会影响细胞计数方法，精心设计的DOE有助于理解每个因素的作用以及各个因素在细胞计数过程中的联系。
细胞计数验证
基于现有的经验，很多参会者推荐了国际人类用药物技术要求协调理事会（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的指南：“Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) for Validation of Analytical Methods”【1】用于细胞计数方法验证。ICH传统上专注于药物制造，而不是细胞治疗产品。指南中描述了准确度、精密度、特异性、检测限、定量限、线性、范围和稳健性的概念。这个通用的验证框架在很大程度上适用于细胞的分析测量，但对于细胞治疗产品要做出一些针对性的调整。
受限于动态、复杂，有时数量还有限的样品，需要对验证步骤进行改变，或者增加额外的考量。例如在考察细胞计数中间精密度（不同操作者、不同仪器、不同日期、不同批次之间的差异）时，实验设计时需要考虑整个周期中样品的稳定性，尤其需要考虑可能影响细胞计数的样品性质（如细胞活率、细胞聚集、碎片和气泡形成等）。
Figure 3. Acceptability of cell counting measurements. Typical cell counting measurements are evaluated and optimized for precision, however, due to the lack of appropriate reference materials, accuracy is not always well understood.
准确度对细胞计数来说，是个独特的挑战。理想的细胞计数计数结果应该既精密又准确。细胞计数的精密度可以通过实验确定。但因为缺少合适的参考样品和对照方法，细胞计数的准确度很难获得。
评估准确度一般是通过对比测定结果与具有参考值和已知不确定性的恰当参考样品的检测结果，或者通过与对照方法进行比较。因为细胞计数测定缺少通用的参考样品，基于人工显微镜观察计数的“金标准”也具有很大的偏差和不精密性，通过上述方法检测准确度不能满足细胞治疗产品对准确度的要求。
为了满足工业界的需要，NIST近期开发出了在没有合适对照方法和样品的情况下，评估细胞计数方法的策略。这些方法通过系列稀释试验设计，评估了细胞计数方法的精密度和比例性。在这样的实验设计中，细胞计数结果对梯度稀释的比例响应作为评价计数质量的内部基准【2】。这个过程不受测定方法和细胞类型的影响，提供了不依赖于“金标准”方法或参考样品比较，就可以评估细胞计数方法质量的途径。这个策略的目标就是解决细胞治疗产品生产者在细胞计数方法转型或者选择“fit for purpose”计数方法时遇到的挑战。
细胞计数的生物或非生物参考样品及内参
合适的参考样品将极大的有助于对细胞计数准确度的评估，有利于对细胞计数方法之间进行比较。因此，研讨会讨论中很重要的一部分就集中在现今细胞计数参考样品的使用和参考样品的需求上。会上达成了一个重要共识：使用者需要理解各种参考样品在计数过程中的作用。细胞治疗从业者需要优化的或者新的参考样品来评估细胞计数的准确度。会上讨论了生物的（基于细胞）和非生物的（主要是微珠）参考样品的作用。有人指出针对测定过程的特定方面需要选择合适的参考样品，且不应在其预期使用目的之外进行过度解读。
细胞计数计量保证策略
为了保证测量结果的质量，需要使用基于计量科学原则的计量保证策略。理想的测量结果由以下3点构成：（i）以常用单位表示的数值，（ii）测量不确定度，（iii）可以保证测量结果质量的证据。对细胞计数来说，了解测量过程是否会以及何时会达不到标准很重要。在这种情况下，需要设计计量保证策略以提供足够的证据来监测测量过程的质量，提供计数结果是否可靠的指示。测量保证的证据通常以测量过程中的中间测量形式出现，在整个测量过程中的特定点建立可信度。测量保证策略可以每年或每季度不定期实施，通过验证和SOP作为质量保证计划的一部分。仪器验证步骤等其他策略可以为每天的测量提供保证；或者与每次测量同时进行，以提供每个测量值的可信度。
Figure 4. Example of a hypothetical cell counting measurement with in-measurement-process controls to provide evidence that the user should have confidence in the value obtained by the measurement process. Spec, specification; LOD, limit of detection.
当计量保证策略应用到每次测量中时，它们作为测量步骤中的控制环节，为测量过程提供同时验证。这种策略在长期记录和监测一种分析方法时非常有效，并能够识别方法中的偏移和错误。很多测量步骤中的控制环节可以直接使用细胞计数的数据，或者通过使用测试样品即可进行的简单实验来完成。这样的设计策略具有实际可操作性。例如，细胞计数结果是单位体积的细胞数；在使用细胞计数值做出决策之前我们有几个假设。这些假设包括：（i）细胞是悬浮于介质中的单个物体，（ii）所有目标细胞都被计数了，而其他的都被排除了，（iii）已知体积已经被验证过，（iv）试剂和仪器工作正常，（v）检测结果在线性范围内，在检出限以上，在饱和限以下。在测量时需要收集证明以上假设是可信的证据。例如，需要设置对照试验和数据分析策略，在试剂出现问题、细胞过度聚集、流路堵塞、仪器状态改变或预设体积错误时提醒使用者。当设置了合适的测量步骤中的控制环节，细胞计数测定过程的质量才能获得保证（图4）。
总结：
本次细胞计数研讨会的一个关键结论就是：获得高质量细胞计数结果的方法并不是单一的。使用者必须要考虑细胞计数的目的，设计最合适的方法和计量保证策略。人们需要开发、鉴定和验证细胞计数方法的通用策略和原则，这些前期的努力会决定后期标准化的考虑和努力方向。关于细胞计数的建议包括：（i）文件标准和最佳实践指南，（ii）一致的术语，以实现共同理解和清晰的沟通，（iii）生物以及非生物参考样品以提升计量保证，（iv）有别于“one-size fits all”观念的，基于“fit-for-purpose”原则的个体化检测策略。
[1] ICH. Validation of analytical procedures: text and methodology. In:
Secretariat I, editor. ICH HarmonisedTripartite Guideline. Geneva,
Switzerland: ICH; 2005.
[2] Sarkar S, Lund SP, Vyzasatya R, Vanguri P, Elliott JT, Plant AL, et
al. Evaluating the quality of a cell counting measurement process via a
dilution series experimental design. Cytotherapy 2017;19:1509–21.
