细胞治疗中的细胞计数国际标准（一）
近年来，由于细胞治疗方法的兴起，人们日益需求能够高质量、稳健、有效进行细胞表征测定的方法。细胞计数，作为细胞疗法中最基础的检测项目，现今需要更高的检测可信度。那么，细胞计数方法在国际上有标准吗？2017年4月，美国国家标准与技术研究院（NIST）&食品与药物管理局（FDA）共同举办了一场专注于细胞计数的研讨会，聚焦于选择、设计和验证细胞计数方法，以及如何得到充分的计量保证。近50位来自于工业界、学术界和政府监管机构的专家参与了研讨会。Nexcelom Bioscience作为为数不多的受邀细胞计数设备制造商之一列席参加了本次会议，与业界专家们共同讨论细胞治疗中关于细胞计数的各种问题。本文总结了此次会议的讨论重点。（文末点击“阅读原文”下载英文全文）
研讨会的总体主题：我们需要根据细胞样品的属性，细胞计数的目的和要求，来选择适合目的（fit-for purpose）的测量方法。例如，药物筛选和细胞治疗产品生产与放行过程中的细胞计数要求会有显著不同。Fit-for purpose是指选择的方法是否适合细胞计数的预期目的。理想的适用性需要满足两方面的要求，一是能解决生物学问题，二是获得的数据质量（灵敏度、精密度、准确度）足够好，足以支持下游决策。一个更标准化的设计、限定和验证符合fit-for purpose原则的细胞计数方法的流程，将加速产品的开发和转化。
研讨会上讨论的主要内容：
细胞计数测量过程
细胞计数遵循相同的常规步骤：（i）样品准备，（ii）手工计数或使用仪器设备的自动计数，（iii）数据分析（如图1）。
测量过程中的很多方面都可能给结果带来显著的可变性。此外作为测量过程中“输入”的细胞样品，属性可能会有大范围的波动，也会给计数结果带来显著的可变性。细胞样品本身就很复杂，具有一系列稳定或者变化的性质
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样品配方（如培养基组分）、成分（如不同细胞类型和功能）和固有的生物学可变性（如供体变化和细胞状态）。认识到细胞计数过程和细胞样品相关的各种影响因素，研讨会上专家们讨论了提高细胞计数可信度的策略。
从监管角角度看细胞计数
FDA的与会人员强调了细胞计数对于检测细胞治疗产品质量（如属性、纯度、效价和剂量）的重要性。他们重申基于不同目的，最适合的细胞计数方法可能不同，这主要取决于细胞治疗产品本身。他们进一步指出，虽然在获得许可证之前，细胞计数等试验方法不需要进行验证；但越早建立高可信度的方法，越有利于产品转化（图2）。FDA与会人员特别指出：确定适当的细胞计数方法，了解可用的仪器，有助于共识性文件标准的制定和参考样品的开发，有利于解决再生医学疗法中细胞计数方面的挑战。
建立细胞计数方面的质量属性
细胞治疗产品的质量属性可通过测定相关的、可测量的生物学指标来评估。许多质量属性直接（如总细胞浓度、活细胞浓度）或间接（如使用细胞浓度归一化处理的活力数据）使用细胞计数结果获得数据。选择细胞计数方法时，要明确理解测量对象和预期质量属性之间的关系（如活细胞浓度、存活率百分比）。
例如活细胞浓度是一种差异细胞计数，需要将活细胞与死细胞区分开，与细胞类型无关。活细胞浓度又可以进一步分解成两个属性组成：活细胞数和样品体积。
测定活细胞数时，很多生物学指标可以用来区分活细胞和死细胞。这些生物学指标包括细胞膜完整性、代谢活力和细胞复制能力。生物学指标可以通过不同测试方法测定，且每种测试方法都有不同的测量对象。例如台盼蓝排除和PI核酸染色法都可以通过测试细胞膜完整性来区分活细胞和死细胞。对同一个生物学指标的类似检测，不同染料（大小、亲和力不同）对细胞膜渗透性的固有不同和显示信号（比色或者荧光）的不同，也会导致结果上的差异。
另一个属性组成是样品的体积。体积可以通过校准过的仪器来获得（例如已测定的计数室尺寸）：间接方法如同时用基于流式原理的方法测定已知浓度的微珠；或者通过流量计等方法直接测定。体积测定偏差将导致结果偏差，降低活细胞浓度测定结果精密度。另外在测试活细胞浓度时，仪器与仪器之间结果的差异，有些情况下可能是因为仪器体积校准之间的差异造成的。
总的来说，应选择反映预期测量目的的生物学指标；当应用这些生物学指标时，能够反映细胞治疗产品的作用机理。此外，测量目标应尽可能与生物学指标直接相关。专家强调需要了解细胞计数的生物学基础，特别是当某个细胞亚群被认为与生物学或临床结果相关时的差异细胞计数。
选择与设计细胞计数方法
自18世纪以来，使用血球计数板进行手工计数一直被认为是细胞计数的金标准。研讨会的参会人员表示这种观点现在依然存在。手工计数非常费时，并且误差很大，会给产品开发和生产带来很多问题。随着技术的发展，现在许多基于自动成像和流式原理的方法被用来进行总细胞和亚细胞群计数。可选的方法很多，样品类型以及细胞计数目的也各不相同。
细胞计数检测过程的考虑因素大致上可以分为：（i）生物学相关因素；（ii）测量特性相关因素，包括计量保证策略；（iii）合规性及其他实际因素。生物学相关因素是指计数方法基于生物学指标获得细胞数量的能力。分析方法的测量特性相关因素包括计数方法提供足够特异、精密和稳健数据的能力；控制测量过程中的可变性并确保过程中的可信度的能力也是需要的；另一个需要重点考虑的因素是方法在产品研发管线各个环节中的转化能力。理想情况下，研发过程中使用的细胞计数方法应该能够应用到生产甚至放行中。细胞计数系统需要尽量少的可变因素和校准要求，最好内置自控系统。紧接下来需要考虑的就是合规性，包括是否满足GMP
（Good Manufacturing
Practice）要求。如果不止使用一种计数方法，或者在不同地点使用同一种方法，需要考虑方法之间的可比性。其他需要考虑的实际因素包括：用量、价格、所需时间以及培训。一个特别需要指出的挑战是计数方法能够允许使用者自行修改调整的程度。仪器提供越多的微调设置，将提供更大的灵活性和可优化性；另一方面，增加仪器的灵活性意味着需要更多的培训，以及在生产中做更多记录。
