用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法（二）
2 结果与讨论
2.1 PCR模板DNA的快速制备
本方法是将少量植物叶片在TE溶液或去离子水中，经钨合金珠在离心管内的振荡破碎，直接获得DNA溶液。用多功能组织细胞研磨器（MTM-60）一次可操作60个样品。琼脂糖凝胶电泳表明，用TE和去离子水都可获得分子量较大的DNA片段（图1A）。用TE制备的DNA在4℃下可保存10天以上，在冷冻下可保存半年。而用去离子水制备的DNA容易降解，保存时间较短，因此我们采用TE为主。
图1 本方法制备的水稻和拟南芥基因组DNA。
注：A: 用TE（泳道1～5）和去离子水（泳道6～10）制备的水稻基因组DNA (4～6mg叶片/200μl)。 M为分子量标记。B, C: 用200μl TE制备的不同浓度的水稻（B）和拟南芥（C）基因组DNA。泳道1～3为4～6mg叶片；4～6为12～15mg叶片；7～9为约25～30mg叶片。
2.2 不同量的模板DNA的PCR扩增效果
本方法制备的基因组DNA没有经过纯化，含有各种可能抑制Taq酶活性的杂质。因此，加入过多的粗制DNA可能会影响PCR反应。为了找出适合于PCR反应的DNA量，我们在一定量的TE（200μl）中加入不同量（4～6mg、12～15mg和25～30mg）的水稻和拟南芥叶片制备基因组DNA（图1，B,
C）。选用2对水稻的引物（PR1、PR2，扩增产物长度分别为540bp和890bp）和1对拟南芥引物（PA, 扩增产物长度为1
kb），取1μl
DNA在20μl的体系进行PCR反应。结果表明，对扩增较小的DNA片段，所有模板都能扩增出产物，但用4～6mg叶片制备的模板DNA获得最好的扩增效果（图2A）。对扩增较大的DNA片段，只有用4～6mg叶片制备的模板DNA获得较稳定的扩增效果（图2B,
C）。
图2 不同量的基因组DNA为模板的PCR反应的琼脂糖凝胶（1％）检测
注：A，B，C分别为用引物PR1，PR2，和PA进行PCR。在所有反应（20μl）含有1U Taq酶和1μl基因组DNA；泳道1～3，4～6，7～9分别为以4～6mg，12～15mg，和25～30mg叶片在200μl TE中制备的基因组DNA。
本实验说明，用4～6mg（可以多至约10mg）叶片/200μl TE的比例制备基因组DNA溶液所含的杂质浓度较低，加入1μlDNA溶液到20μl反应体系中不会抑制Taq酶的活性。而加入1μl较高浓度的模板DNA对PCR反应的抑制作用较大。由于模板DNA量较少（约1～2ng/μl），PCR循环数比用较大量的纯化DNA模板（一般用20~50ng）的PCR要多些（多3～5个循环）。虽然可以将用较多叶片制备的模板DNA稀释使用或加入较少量（<1μl）的模板DNA也能获得好的PCR效果，但从简化操作步骤，提高工作效率考虑，确定最佳的经验值对效率化的大规模样品检测尤为重要。由于加入的样品叶片量有一个合适的范围，在实际操作中，并不需要所有样品都用天平称取，以经验目测估算即可。
2.3用于分子标记的基因型分析
由于用本方法制备的基因组DNA可以PCR扩增出较大的目的片段，对于PCR分子标记，如微卫星（SSR）、插入/缺失（InDel）、单核苷酸多态（SNP）等检测较短的DNA片段（一般<200bp）应该是可行的。我们用4对位于水稻籼粳杂种花粉不育基因Sc（Yang
et al.,
2008）连锁区的InDel标记引物（表1）对F2群体进行的基因型分析。图3显示了部分结果，所有标记的PCR扩增效果稳定，聚丙烯酰胺凝胶电泳的DNA条带均清晰易辨。
图3 用InDel分子标记的水稻基因型检测
注：A～D分别为用引物L14-121，J04-91，P24-83，和P24-93的PCR。左边起第1和第2泳道分别为亲本E5和T65、其它泳道均为F2个体。
已报道植物基因组DNA制备的方法很多，如经典的SDS法、CTAB法，另外还有一些简化的制备方法,如SDS一步法（王会文等，2002）、微波炉水煮法（黄小乐等，2002）、TE研磨法（罗文永等，2002）、NaOH处理幼叶直接作为PCR模板法（汪秀峰等，2002）、简易提取法（陈文岳等，2005）、剪切法（赵红霞等，2006）。对需要对大量样品进行基因型分析的研究来说，这些方法的操作效率不够高，或制备的模板DNA的扩增结果不理想，常常不能扩增出目的片段。本研究提出的DNA制备方法简单，大大缩短了时间，适合操作大量的样品，而且PCR效果和重复性好，需要叶片量也很少，所需的仪器（多功能组织细胞研磨器）价格低，因此实验成本低。我们用本方法已制备了数万的水稻样品用于各种分子标记（SSR、InDel、SNP）和转基因的基因型检测。
