用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法(一)
一种用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法
来源:方统科技
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摘要: 本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法。该方法只需将少量(4~6mg)植物叶片、适量(200μl) TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管,在组织细胞研磨器中振动5min破碎组织后,直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大量样品的基因型检测。
王兰1, 2 龙云铭2 刘耀光2
1 华南农业大学农学院,广东省植物分子育种重点实验室
2 华南农业大学生命科学学院,广东省教育厅植物功能基因组与生物技术重点实验室
摘要:本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法。该方法只需将少量(4~6mg)植物叶片、适量(200μl) TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管,在组织细胞研磨器中振动5min破碎组织后,直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大量样品的基因型检测。
关键词: 水稻,DNA制备,PCR
随着生物技术的迅速发展,PCR技术已广泛应用于遗传育种的各个领域,如种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。在大规模的基于PCR的基因型检测作业中,高效快速的模板DNA制备显得非常重要。自Marmur 1961年建立用十二烷基磺酸钠(SDS)和氯仿从生物细胞中分离提取DNA样品的经典方法以来,人们一直致力于对DNA抽提方法的探讨,并先后报道了一些关于DNA抽提的方法(Dellaporta et al., 1983; 宣朴等,1998;汪秀峰等,2002;周淑芬等,2004)。但这些方法仍然烦琐费时。本研究对作为PCR模板的植物基因组DNA制备方法作了简化,只需将少量叶片、适量TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管,在组织细胞研磨器中振荡约5min破碎组织后,直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大规模的基因型检测。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为粳稻品种台中65(T65)及其杂种不育基因Sc的近等基因系E5,以及它们杂交组合构建的F2群体,以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Columbia。
1.2 基因组DNA制备方法
剪取(或用手摘取)水稻苗或成株叶片(剪成约3~5mm小段)或拟南芥叶片约4~6mg,12~15mg,或25~30mg,放入2ml离心管中(注:2ml离心管的底部较宽,利于钨合金珠的振荡),加入200μl
TE (10mmol/L Tris, pH8.0; 0.5mmol/L EDTA, pH8.0.
注:本TE中的EDTA浓度是常规TE的1/2)或200μl去离子水,放入一粒3mm直径的钨合金珠(Qiagen,
Cat.69997),在多功能组织细胞研磨器(方统生物科技有限公司,型号MTM-60)上振动约5min,把叶片打碎。取17μl溶液以琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA质量,取1μl溶液用于PCR扩增。
1.3 PCR引物反应
根据公共数据库的水稻和拟南芥基因组序列设计PCR引物(表1),由英俊公司合成。Taq酶从杰顺公司购买。
表1 PCR引物序列
引物 | 引物序列 |
PR1 | 5’-TCTGTACAAGTTGAGGAATCTCCG-3’ |
5’-TGCCACCCACAGCAAGCCTTATGA-3’ | |
PR2 | 5’-ACCCCATGGCGACGAATTCC-3’ |
5’-CAGATTAAGGCAGGAAGTCC-3’ | |
PA | 5’-GAAACTGATCAGTTGCTTTCAC-3’ |
5’-CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG-3’ | |
L14-121 | 5’-CTTGACAATTGCAAGGCCAA-3’ |
5’-GAGGTAGGCATGAGACATGC-3’ | |
J04-91 | 5’-GTGCGGATCGATCGGCAGCA-3’ |
5’-GCTCAGATCCGGCCAGATTC-3’ | |
P24-83 | 5’-CAGAACAGCATTCAGGCATC-3’ |
5’-ATCCTGATAATGTGTGGCGC-3’ | |
P24-93 | 5’-CATTGGTTAAAGGATGGTAC-3’ |
5’-TAGTACTGCTAGGACCATCC-3’ |
注:PA为拟南芥引物,其余为水稻引物,其中L14-121~P24-93为插入/缺失(InDel)标记引物。
每个PCR反应液(20μl)组成为:1× Buffer,0.2mmole/L dNTPs, 1U Taq酶,250nmole/L每种引物,1μl上述DNA溶液。PCR反应在My Cycler (BioRad)热循环仪上进行。用引物反应程序为94℃预变性3min,扩增35个循环,每个循环94℃ 20s, 55~58℃ 30s,72℃ 60s (InDel标记的PCR用30s);最后72℃ 2min。
1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及检测
1.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
配制6%的聚丙烯酰胺凝胶100ml工作液:分别加5.7 g丙烯酰胺
(Acri),0.3g N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis-Acri),12g尿素,10ml
10×TBE,最后加水至100ml。灌胶前,每10ml胶液加入80μl
10%过硫酸铵,4μl四甲基乙二胺(TEMED),摇匀后迅速灌胶,胶凝固后即可点样电泳,并通过银染检测实验结果。
1.4.2 银染
先用0.1% AgNO3染色液染色10~15min,再用显影液(100mL中含NaOH 0.5g、四硼酸钠0.019g, 0.4mL甲醛)显色,等条带清晰后,直接用自来水冲洗终止显色反应,用凝胶成像仪(BioRad)或数码相机拍照并记录实验结果。
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