流式细胞仪的发展历史及其原理与应用进展（二）
流式细胞术发展趋势可归纳为:
①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪;
②对流式细胞术检测荧光参数,从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析,目前最多可同时检测15 种荧光信号;
③从检测参数的相对定量发展为绝对定量;
④从检测参数的手动人工分析发展为利用计算机软件的自动分析;
⑤所采用的荧光试剂,从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切,就要求流式细胞仪使用者和科研人员,一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识,只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。
3 流式细胞术的应用
流式细胞术的应用,简单用一句话概括就是,凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域,因为最初这个技术就是为此目的而设计的。
3.1 流式细胞术在细胞生物学中的应用
3.1.1
染色体核型分析 用流式细胞术可将分离的染色体进行分类、纯化。传统的核型分析在取材、培养、涂片、固定后,用分带技术显示出不同染色体的特征信息,然后再显微照相,放大、剪接、组型。这是一个十分费时且不可避免掺有主观因素的技术。目前,用仪器自动分型的方法,一是采用图像技术的静态方法,再有就是采用流式细胞术。后者除可做染色体分析外还可纯化,得到克隆实验所要求的染色体,这是其他任何技术都无法完成的,为此设计专门的特种流式细胞计。
3.1.2
在分子遗传学领域中的应用 流式细胞术的分析功能和分选功能在分子遗传学领域很有用处。分析的功能常用来研究分离的染色体,有时也用来检测或定量测量细胞表面或内部为特异基因所编码的细胞分子;分选的功能可用来分选指定的染色体,然后用来建立人类染色体DNA 文库。
3.1.3
用于家畜性别的预选择 将家畜的X、Y精子分选出来,达到控制胎畜性别的目的。此外,在精子发生学、睾丸瘤、不育症、药物对精细胞的干扰等研究中,都可使用流式细胞术进行定量研究。
3.1.4
在微生物学中的应用 流式细胞技术在真核细胞生物学方面,特别是哺乳类细胞学方面有重要贡献,在微生物学方面的应用则发展相对较晚。实际上,微生物学,尤其是细菌学当前面临的一些问题,特别是需要对大数量细菌进行逐个的快速多参数精确测量时,流式细胞术很适合解决此类问题。已发表的论文多数是针对酵母菌和各类细菌的测量与分析。酵母菌的测量在技术上比较简单,它自身体积大,其DNA
含量约为人类二倍体细胞DNA 含量的1/ 200。已用定量DNA、RNA
和光散射方法研究酵母菌的细胞周期。用同样方法和目的,也对原生生物、藻类和霉菌类以及各种重金属对其的影响进行研究。另外用FITC
结合的抗血清可作种系鉴别,应用此项技术已能代替临床上经典的费时繁琐的细菌抗生素敏感试验和传染活性的测定。在工业中,流式细胞术可用于快速微生物鉴定,如对饮用水及原油中的微生物学鉴定与控制。
3.1.5 在细胞周期研究中的应用 在生物细胞核中,DNA 含量并非恒定,随细胞增殖周期时相不同而发生变化。G0
期是第一次细胞分裂完成后进入第二次分裂开始前的阶段。G0 期细胞是不参与细胞增殖的一群细胞,为静止期细胞,其细胞DNA
含量为较恒定的二倍体(diploid) 。G1 期指第二次分裂开始到本次DNA 复制之前的过程,此期主要功能是积累能量和原料为DNA
的复制做准备,故又称DNA 合成前期。G1 期细胞具有增殖活性,开始有RNA 的合成;G0 期和Gl
期是细胞处于周期过程中两种不同功能状态时相的细胞,不能视为同一细胞,但就DNA 含量而言,两者相同,均为二倍体DNA 含量。S 期又称DNA
合成期,合成及复制DNA。当细胞进入S 期后,DNA 含量值逐渐从二倍体～四倍体增加,直到细胞DNA 倍增结束,进入G2 期。G2 期指从DNA
复制完成到有丝分裂开始的时间区间,又称DNA 合成后期或有丝分裂前期,此期合成大量蛋白质,为M期的细胞分裂做准备。经过G2
期后细胞最终进入M期,即有丝分裂期。在M期分裂为两个子细胞之前,G2 期和M期的DNA 含量均为恒定的四倍体细胞群。FCM分析细胞周期与DNA
倍体时,需对DNA进行染色。DNA 荧光染料与细胞DNA 双链的结合有一定量效关系,即DNA 含量的多少与PI
结合量成正比,因此通过荧光强度可以反映细胞内DNA 的含量。
3.2 流式细胞术在医学中的应用
3.2.1
在免疫学中的应用 随着单克隆抗体技术、荧光色素化学等技术的发展,流式细胞术成为当代新技术的“杂交体”。正像免疫学作为一种不断发展的学科和技术手段延伸到生物、医学及其他领域一样,流式细胞术也以它的快速、灵活和定量的特点,广泛地被应用于免疫理论研究和临床实践应用的各方面,所以有人称之为现代免疫技术基石之一。尤其同单克隆抗体结合应用,在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监督、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面都起着相当重要的作用。随着细胞学、病理学、免疫学、肿瘤学研究发展的需要、流式细胞测定技术也不断得到充实和完善。它不仅在功能上作为荧光显微镜的补充,而且因具备二者的全部功能和特点,从而在免疫及有关各学科领域发挥出更重要的作用。
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技术原理
