金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法介绍--反向间接血凝法
反向间接血凝法
测定原理是致敏血球与被检液的相应抗原发生凝聚反应即出现反向间接血凝现象。
(1)试剂
①反向间接血凝诊断试剂盒。
②1%致敏血球(各型):用砂轮打开冻干致敏血球的安瓿,加3mL 生理盐水溶解,于37℃水浴1h 后使用。
③1%正常兔血清盐水:用砂轮打开冻干正常兔血清的安瓿,加0.5mL 生理盐水溶解吸入装有生理盐水(50mL)的容器中即成1%正常兔血清盐水。
④0.85%生理盐水。
⑤聚乙二醇(MW200000)。
(2)设备与材料
①均质器及均质杯(250mL)。
②离心机及离心瓶(250mL)。
③透析袋(MW12000～14000)。
④血凝反应板(96孔)。
⑤微量加样器(25μL)。
⑥微量混合器。
⑦培养箱。
(3)操作步骤
①称取蘑菇罐头中的汤与固形物各50g,放入均质杯中,加入0.85%NaCl 100mL,高速均质3min。
②均质后的混合物置离心瓶中,以4500r/min 离心30min。
③吸上清液,装入透析袋内,包埋于 PEG 中,4℃浓缩过夜。
④用3mL 生理盐水分数次将透析袋内容物洗出。
⑤将样品液移入5mL 离心管中,7000～8000r/min 离心20min。
⑥吸取上清液测定 PH 值,并根据具体情况用1mol/L NaOH 或1mol/L HCl 调 PH 值为7.0,待作反向间接血凝试验。
(4)检测
①根据样品量的多少来确定在同一块板上做几种型别的肠毒素抗体致敏血球(以下简称致敏血球)。但每一型致敏血球都必须有一个阳性对照(标准肠毒素)和一个阴性对照(1%正常兔血清盐水)。实验前要预先在记录纸上把每一孔要加入的样品及致敏血球做好标记。
②在样品中加入30%正常兔血清盐水0.1mL,充分混匀,使样品液中最终含有1%正常兔血清。(注意:若样品液保存在4℃冰箱中,检测前应置室温平衡。)
③用微量加样器在每孔中加入25μL 的样品液。
④在阴性对照孔中加入25μL 正常兔血清盐水。
⑤在阳性对照孔中加入25μL 适当稀释浓度的标准肠毒素。该浓度可预先用不同浓度梯度的肠毒素做实验而定,一般取阳性结果为四个加号的最高稀释度为宜。
⑥观察每一孔中加样完毕后是否有气泡存在,用灭菌的接种针将气泡排除。
⑦于上述每一孔中迅速加入25μL1%的致敏血球(若血球是放冰箱保存的,使用前应置室温平衡)。
⑧把血凝反应板放在微量混合器上充分振荡混匀1min。
⑨取下血凝反应板,用璃璃板盖住表面置37℃静置2h 后观察结果。
(5)结果判定
①++++:血球呈均匀凝集,布满整个孔。
②+++:血球大部分凝集,较①稍小。
③++:血球50%凝集,边缘较松散,孔底有少量颗粒沉积。
④+:血球在孔底沉淀面积较大,周围有散在的少量凝集。
⑤±:血球下沉至孔底,周围有较小凝集。
⑥-:血球下沉至孔底呈点状,边缘控齐。
一般“++”以上做为阳性结果。
