艰难梭菌感染的实验室检测技术及临床意义
艰难梭菌（Clostridium difficile, CD）又称难辨梭状芽孢杆菌，广泛分布于自然环境、人类和动物的粪便中，是医院内肠道感染的重要致病菌之一。艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection, CDI）患者的临床表现可为自限性腹泻，重者可出现伪膜性肠炎，甚至中毒性巨结肠。临床大量不合理使用广谱抗生素、免疫抑制剂、质子泵抑制剂或化疗药物后，破坏人体正常的肠道微生态平衡，致CD过度生长并释放肠毒素、细胞毒素和二元毒素，引起CD相关性腹泻（Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD）。
近年来由于出现新型高产毒株027/NAPI/BI型CD，欧洲和北美相继发生暴发流行，给临床诊疗提出了新的挑战；同时高发人群除住院及老年患者外，尚有既往身体健康未曾住院且未用过抗生素的人群，社区获得性CD感染的病例数呈逐年上升趋势，并在获得的菌株中既发现了与院内感染同源的高致病株也有新型菌株和新的毒力基因，因此已引起全球高度关注。
快速、敏感、准确的实验室诊断对确定CD感染病源、发现CD流行病学变化、控制其传播、确保有效治疗显得极其重要。
一、粪便厌氧培养
CD属专性厌氧菌，对培养基的要求较高，需要用环丝氨酸－头孢西丁－果糖琼脂（cycloserine-cefoxitin fructose agar，CCFA）作选择性培养基。在厌氧环境中CCFA平板上18～24ｈ后，长出黄色毛边样粗糙菌落，紫外线照射下可见黄绿色荧光。加有牛磺胆酸钠的环丝氨酸头孢西丁果糖肉汤（taurocholate cycloserine cefoxitin fructose broth, TCCFB）可富集芽孢，用无水乙醇处理，离心取沉淀再接种于CCFA中厌氧培养，阳性率可明显提高。另外成本较低的改良CD布鲁琼脂（Clostridium difficile blue agar， CDBA）和CD布鲁肉汤（Clostridium difficile blue broth， CDBB）培养基可达到与CCFA相当的分离率，而原型显色培养基（IDCD）对新鲜粪便标本和经乙醇处理过的粪便标本分离率明显高于其他选择性培养基，是一种值得推荐的新方法。粪便培养厌氧要求高，所需时间长，只有小部分实验室能进行，多次粪标本送检可提高阳性率，其优点是能进行抗菌药物敏感性检测，并可对分离的菌株进行分子生物学分型和流行病学分析，但不能确定其是否产生毒素。
二、细胞毒性实验（cytotoxicity assay, CCTA）
CCTA是检测单层培养细胞由毒素所致的变性、坏死、凋亡等细胞病变效应。将粪便滤液与Vero或HepG2细胞一起孵育，分别加入和不加入抗毒素A/B的中和抗体，然后分别在24、48ｈ显微镜下观察是否有细胞病变效应，而加入抗毒素抗体能阻止这种细胞病变。若50%以上的病变细胞在48ｈ内可以被中和，则为阳性。该法可以检测到1 pg水平的毒素，灵敏度为67%～90%，被认为是传统实验室确诊CDI的“金标准”。由于需要相应设施和技术，且耗时长，结果带有一定的主观性，也难以在临床常规实验室应用。
三、毒力生成细胞培养试验（toxicity generation cell culture test, TGCC）
TGCC是厌氧培养与毒素B检测相结合的一种方法。粪便标本处理后，用选择性培养基对CD孢子进行厌氧纯培养，然后检测毒素。由于其灵敏度要高于传统金标准CCTA，美国食品药品监督管理局要求在进行CD检测新方法评价时须将TGCC作为参比方法。但TGCC的特异性低于CCTA，检测时间长。
四、免疫学方法
可直接用粪便标本进行检测，不必依赖菌株的培养分离。
1. CD谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase, GDH）检测：GDH为CD细胞壁表面抗原性蛋白，此法阴性预测值高，敏感度约为85%，并与菌株类型有关。但GDH也可存在于无毒性CD和某些其他细菌中，故适合做初筛指标。
2. 毒素A、B检测：目前应用较广的是毒素A和（或）毒素B快速检测，操作简单，特异度高，能区分产毒株和不产毒株。但敏感度不如培养法，假阴性率高，且不能得到菌株用于进一步研究。检测敏感度存在较大差异的原因可能是样本转运贮存过程中毒素蛋白的降解、毒素在肠道内的聚合作用和目标蛋白的遗传多样性。首次检测若为阴性，但临床高度怀疑CDAD，则要再次检测，并进行细胞毒性测定加以确认。
五、分子生物学方法
１．普通PCR：厌氧培养得到菌株后检测毒素A和B的编码基因（tcdA和tcdB）以及二元毒素基因cdtA、cdtB和tcdC片段缺失情况，编码基因检测可预测产毒性CD的存在及其产毒能力强弱。
２．实时荧光定量ＰＣＲ：它以毒素B基因的一段保守区域为靶点设计引物，通过实时检测PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号，实现tcdA和tcdB的检测。该方法特异度好、敏感度高、检测时间短，可替代大便培养，适用于大规模样本筛查，特别是处理公共卫生突发事件。
３．环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）：针对靶基因设计特异性引物，通过高活性的链置换DNA聚合酶（BstDNA聚合酶）进行恒温（63～67 ℃）扩增，特点是等温条件下即可高效、快速地扩增靶序列。操作方便，在1ｈ内可得出结果。
４．结合Allglo探针技术的多重荧光定量PCR：针对CD tcdA和tcdB基因设计引物和相应的Allglo探针，优化PCR扩增体系，可准确、特异地同时检测CD tcdA和tcdB基因，菌体的灵敏度可达到10 CFU/ml，批间和批内变异系数均小于5%。
不同的PCR方法是否等效有待进行全面评估。高比例的无症状携带者以及腹泻原因的复杂化，导致PCR方法有一定的假阳性，另外PCR方法也不能用于治疗后临床疗效的判断。
六、基因分型
CD基因分型对了解CDAD的溯源、菌群结构和流行菌株谱系变化有重要作用。方法包括脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel clectrophoresis, PFGE）、PCR核糖体分型和多位点序列分型（multifocus sequence typing，MLST）。其中PFGE应用较多，通常作为细菌分型的金标准；PCR核糖体分型条件要求低，操作方便。但二者都需要参考菌株，且无法进行实验室间的比较。MLST是利用管家基因设计引物，得出每个菌株各位点的等位基因数值，构建系统树图进行聚类分析，无需参考菌株，可建立公共数据库进行实验室之间比较，用于细菌群体遗传学及分子流行病学研究。
七、检测样本送检要求
粪便标本应采集水样便或稀便，盛于洁净密封容器并尽快送达实验室。CD的毒素活性在储存过程中会降低，尤其是多次反复冻融。2～8 ℃中可保存24ｈ，若保存时间需更长则冻存于－70 ℃。
目前我国开展CDI检测的医院不多，主要进行毒素A/B检测，方法学研究和评价以及流行病学应用研究仍处于起步阶段。由于实验室检测方法的局限性，正确解读检测结果应根据患者病史、临床症状、风险因素、检测原理等进行综合分析。
