在New Brunswick S41i CO2恒温摇床内采用透气袋实现人类T细...2
创建低温保存T细胞库和冷冻培养基配方
创建细胞库对本研究而言非常重要， 因为在进行广泛研究时， 购买多瓶原代人类 T细胞会使得成本过高。 一旦发现T细胞扩增的最佳条件，
便选择一包密度最高、 生存能力最强的Evolve袋复冻回细胞库中。 低温保存的培养基配方如表2所示。
首先，向已用培养基的细胞内再添加5%的热灭活人血清，将血清总浓度提升至 10%。然后，向该混合液内注入新鲜培养基。不得使用离心机对细胞进行标准回
冻等离心操作， 而是将DMSO直接添加到细胞和培养基的混合物中。 然后， 将其 分配到1 mL的低温保存管中。 随后，
将低温保存管放入BioCision CoolCell， 置 于温度设置为-80 ˚C的New Brunswick Innova U360
ULT冰箱内过夜。 24小时后， 将其移入液态氮中进行长期保存。
优化Evolve透气袋的培养条件
解冻法得到优化后， 则针对理想的细胞生长和扩增能力对Evolve袋进行进一步评 估。 T细胞直接解冻至最大灌注量为120
mL的Evolve袋中， 工作容积为30 mL， 密度为0.5 x 106 cells/mL。 通过加入新鲜的完全培养基维持该密度水平， 直到工
作容积达到100 mL。 当袋子达到100 mL工作容积后， 根据需要， 可通过取出50 mL培养基， 替换成新鲜的完全培养基，
实现50%的容积置换， 以维持0.5 x 106 cells/mL的密度水平。
比较摇瓶和透气袋中的T细胞培养
此外， 本研究还使用了New Brunswick S41i Co2恒温摇床对不同振荡速度下带挡
板和不带挡板的一次性摇瓶培养和透气袋培养方案进行了比较。 每个摇瓶的接种 密度都为0.5 x 106 cells/mL， 利用了250
mL摇瓶20%的工作容积。 作为对照， 也采用上述标准最佳设定值和接种密度将T细胞放置在工作容积为100 mL的120 mL
Evolve细胞培养袋中进行生长。
使用不同的透气袋评估扩大规模的可能性
当优化了120 mL Evolve袋T细胞培养后， 便开始尝试扩大规模， 首先从500 mL Evolve袋开始。 情况与上述情况一致。
我们还对另一制造商相似容积的透气袋的培养效果进行了研究。 除了大尺寸Evolve袋， 我们还使用了Lampire Biological
Laboratories OMNI C3 250 mL细胞培养袋。 虽然Evolve袋的最大灌注量为500 mL， 我们只使用了200
mL工作容积， 以便将其与最大工作容积相对较小的Lampire袋进行比较。
结果与讨论
优化T细胞解冻方法和初始培养
我们对T细胞采取了两种解冻方法， 一种遵守了制造商建议的静置培养保持时间， 另一种则没有（见材料和方法）。
每天对两种培养基进行取样并监测细胞生长和存 活率。 过了初始解冻期后， 将其放入细胞培养袋中进一步培养，
细胞密度维持在0.5×106cells/mL水平， 并加入新鲜培养基以达到100 mL最大工作容积。 继续采用直 接解冻至袋中的方法。
相比悬浮方瓶静置解冻法， 该方法不仅更为方便， 峰值细胞密度也超过了前者。数据如图3所示。
图3： 静置解冻法与直接解冻至袋内比较（解冻后， 都采用为期8天的袋内培养）
建立T细胞低温保存库
许多制造商不保证低温保存后细胞能够存活。 然而， 我们已经通过自己的处理技术和培养基配方证明了可以将细胞保存起来， 以备将来使用（图4）。
图4： 将T细胞从低温保存细胞库取出解冻后， 在透气袋内培养生长， 并进行为期5天的监测
比较摇瓶和透气袋中的T细胞培养
摇瓶内培养的细胞生长密度并未达到同期透气袋培养的细胞密度水平。 如图5所示。 由于摇瓶和细胞培养袋的工作容积不同， 图5显示的是50
mL灌注量获得的细胞总 数， 以便进行比较。 在95和100 rpm的摇瓶培养中也观察到大量的细胞团。 在70
rpm摇瓶和透气袋培养中未观察到细胞团。 鉴于摇瓶培养表现不佳， 我们放弃了摇瓶 法， 将重点放在透气袋培养上，
并利用更大尺寸的透气袋进一步探索扩大规模的可能。
使用不同的透气袋评估扩大规模的可能性
为了确定Evolve袋是否是扩大生物反应器接种T细胞规模的理想方法， 本研究测试了另一制造商的细胞培养袋。 每天对每个袋子进行取样， 连续7天。
结果如图6所示， 200 mL工作容积的Lampire袋的密度大于较大尺寸的Evolve袋。 虽然峰值密度低于120 mL的Evolve袋，
但Lampire袋的总细胞数量比较大尺寸的Evolve袋高出了2.5 倍 （未显示数据）。 我们还测试了1 L到5 L的更大尺寸的透气袋，
但在最初的评估中未能成功实现T细胞扩增。
图5： 在塑料摇瓶中以不同振荡速度培养的T细胞相比透气袋培养的效果
图6： 比较较大尺寸的Evolve透气袋和Lampire透气袋在人类T细胞扩增方面的表现
结论
通过本研究， 成功地建立了细胞库以便进行进一步的实验。 在Evolve透气袋中， T细胞扩增明显。 采用120 mL Evolve透气袋时，
New Brunswick S41i CO2恒温摇床 的振荡平台共可容纳10包Evolve袋。 如果10个Evolve袋的灌注量都为100
mL， 且密度均达到3.91 x 108个细胞/袋（图3）， 则1 L液体就可以达到3.91 x 109个T细胞存 活总量。在该密度条件下，
BioBLU 3c一次性罐在3.75 L最大工作容积时，可接种大约255 mL的细胞数量。 利用S41i恒温摇床扩增的单批T细胞， 可实现1
L细胞接种 4台达到最大工作容积(3.75 L) 的BioBLU 3c一次性罐。
对Lampire透气袋的初步研究也显示了可以扩大规模的潜力。 Lampire袋的最大工作容积为250 mL。 本研究中， 其工作容积为200
mL。 S41i Co2恒温摇床2恒温摇床 的振荡平台最多可容纳6包Lampire袋， 可以将细胞总容量扩大至1.2 L。
本研究表明， 透气袋搭配S41i Co2恒温摇床可实现T细胞的快速初始扩增， 其能够产生足量的细胞接种多个台式生物反应器。
参考文献
[1] Khandaker Siddiquee和Ma Sha。 Microcarrier-Based Expansion of
Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Shake Flasks.Bioprocessing
Journal, Volume 12, Issue 4, Winter 2013.
