戊型肝炎病毒感染分子生物学检测方法研究进展
随着戊型肝炎病毒(HEV)分子克隆技术的成功建立，HEV分子生物学的研究取得了极大进展，与之相关的HEV检测方法也正在不断完善。该方法包括两方面，即采用基因工程重组抗原建立的抗体诊断方法，以及采用逆转录——聚合酶链反应(RT-PCR)建立的基因诊断方法，分别检测抗HEV及HEV RNA。
1 抗HEV的检测
利用体外表达的各种HEV重组蛋白，已建立了多种抗HEV检测方法，包括酶联免疫方法(EIA)和蛋白印迹技术(WB)等用于HEV感染的临床诊断和实验研究。
第1代抗HEV EIA检测试剂由3块酶联反应板组成，其中2块反应板分别用HEV的2个亚型——缅甸株HEV和墨西哥株HEV 基因组中的阅读框架ORF 3 所表达的部分多肽作抗原进行包被，第3块板用谷胱甘肽转移酶（GST)包被，作为空白对照板。被检血清分别加入3块反应板，然后加入抗人IgG酶标记物，最后加入底物显色［1，2，3］。该法操作复杂，且只用ORF３1种抗原，灵敏度低，不久即被第2代检测剂所代替。
第2代抗HEV EIA检测试剂大多采用HEV 基因组ORF3-2嵌合抗原进行包被。1991年Yarbough［4］等获得HEV结构基因ORF2和ORF3区的2个克隆406.3-2和406.4-2。次年，Shidmor等［5］采用该两个克隆表达的产物42肽和33肽作抗原，建立了第2代抗HEV EIA检测方法，其灵敏度和特异度分别为63.6%和95.8%。目前世界上较常用的抗HEV EIA检测试剂(包括美国Genlabs)公司生产、新加坡DBL公司生产等)就是用此为抗原建立的。国内学者毕胜利等［6，7，8，9，10］在大肠杆菌中表达了HEV ORF3、HEV ORF2和HEV ORF3-2嵌合抗原，并建立了EIA方法，灵敏度和特异性亦较好。
第3代抗HIV EIA检测试剂为应用真核表达系统生产抗原进行包被。现认为真核表达系统生产的抗原其抗原表位的自然构象未加改变，可能具备更高的免疫原性［11］。Tsarev等［12］应用杆状病毒做为载体在昆虫细胞中表达了ORF2的全部结构基因，用其产物建立了EIA 方法检测戊型肝炎患者血清抗HEV，灵敏度和特异性皆为100%。我站学者李天成等［13］应用该表达系统表达了ORF23"端的大部分基因，其产物为体外自动组装的病毒样中空颗粒，我们实验室用其产物建立的EIA检测试剂［14］检测抗HEV IgG、IgM，灵敏度、特异性均为100%。第3代检测试剂良好的特异性、灵敏度决定将逐步取代第2代检测试剂。
采用WB法检测血清抗HEV，其特异性要比EIA法高，可用来作为戊型肝炎的确诊手段。该法是用HEV重组多肽作聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至硝酸纤维膜上，加入被检血清，血清中的抗HEV即与硝酸纤维膜上的HEV重组多肽结合，然后加入抗人IgG酶标记物，加底物显色。Purdy等［15］用pATH10融合表达系统表达的ORF2 3"端编码的400多个氨基酸构成的重组抗原trpE—C２检测戊型肝炎患者血清标本，检出率为90.9%，检测特异性为100%。Li等［16〕］用GST融合表达系统对ORF3和ORF2的3"端1658bp和830bp基因进行融合表达，产生重组抗原GST—ORF3、GST—ORF2.1(830bp编码)、GST—ORF2.2(1658bp编码)，对戊型肝炎患者血清进行检测，其中急性期患者血清，GST—ORF2.1检出率为92%，GST—ORF3检出率为85%；以恢复期血清的检测结果是：GST—ORF2.1抗体阳性率为47%，GST—ORF3抗体阳性率为16%。虽然WB法检则抗HEV特异性高，但其操作技术相对较为复杂，检测所需时间较长，而且目前尚无商品化的试剂供应，因而该法更多用于戊型肝炎的实验室研究。
为明确抗HEV在戊型肝炎诊断中的确切价值，一方面需要研制质量更为稳定的抗体检测试剂，另一方面需要进行设计严密、大规模、全病程的抗体应答动态观察，彻底探明抗HEV在戊型肝炎病程中的消长规律。在目前情况下，对于具备急性肝炎临床表现的患者，如能排除其它肝炎病毒感染，其血清抗HEV IgG、IgM均为阳性可作为新近有HEV感染的依据。
2 HEV RNA的检测
采用RT—PCR法检测HEV RNA现已广泛应用于HEV的病原学以及分子生物学研究。对HEV的PCR扩增几乎覆盖整个基因组，由于这一病毒基因组碱基组成除ORF1的1500～3000碱基因域有一定变异外，其余部分保守性和特异性都较强，可以对任何一段基因序列进行PCR扩增。首先是1989年Reyes等［17］克隆出HEV的部分基因片段，他们从实验感染HEV的猕猴胆汁中提取出病毒RNA，经PCR 扩增后，在ygt10中构建cDNA文库，经32P标记的探针杂交筛选，获得克隆ET1.1，大小接近1.3Kb，可与猕猴肝脏中的HEV RNA杂交。1991年，Yarbough等［4］克隆出HEV 另一亚型HBV的部分基因片段，他们自墨西哥戊型肝炎病人粪便中分离出病毒RNA，经扩增后，在ygt11中构建cDNA文库，获得406.3—2(ORF2)和406.4—2(ORF3)两个克隆。此后，Tam等［18］、Huang等［19］及Bi等［20］相继采用PCR方法，克隆出HBV、HBV和中国株的全基因序列。
