显微成像小课堂丨告别非焦平面信息干扰
虽然我们常说的分辨率指的焦平面上的分辨率（即XY方向），决定分辨率高下的决定因素是物镜的数值孔径，但是其实在宽场荧光显微镜中，样本中整个被照亮的区域都会发射出荧光，这些非焦平面上的荧光其实对于焦平面上发射出的荧光，也就是我们真正关注的信息来说就是一种干扰，这也可以理解为在Z方向上，也是有分辨率的。为了解决非焦平面信息的干扰，一系列的显微成像方法应运而生。
激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜比传统的宽场荧光显微镜有几个优点，包括可以控制景深、消除离焦平面图像的信息，以及对厚样本进行连续光学切片的能力。共聚焦方法的关键是使用空间过滤，通过针孔照亮物镜，消除比焦平面厚的样品中的聚焦光或耀斑。简而言之，就是在检测端放置一个叫做针孔的装置，过滤来自于非焦平面上的信息（见图6和图8（b））。基于振镜式的扫描系统使聚焦后的激光在样本上形成小点形式的针孔的图像。这个斑点反过来在检测端的针孔上形成一个反射的落射荧光图像。如果样品处于聚焦状态，光通过针孔进入检测器（通常是光电倍增管）。当样品不聚焦时，其反射的光在针孔处离焦，很少通过。因此，从样品返回检测器的荧光在空间被过滤。随着针孔孔径的减小，它会阻止更多的杂散光被检测到，但也会降低总信号水平。虽然绝对信号值远小于用宽场显微镜配置观察到的值，但是从其他焦平面阻挡的光会增加感兴趣特征的信噪比。
激光扫描共聚焦显微镜的其他优点包括能够通过改变激光扫描的区域而不必改变物镜，以电子方式调整放大率。这种特征称为变倍系数，通常通过改变扫描激光采样周期来调整图像的空间分辨率。增大变倍系数会减小扫描样本的面积，同时降低扫描速率。结果是沿着相对长度增加了样本数量，从而提高了图像的空间分辨率和显示放大率。共聚焦变倍通常是在使用低数值孔径和放大倍率物镜采集数据时，用来匹配数字图像分辨率和显微镜的光学分辨率。由于高变倍系数会导致光漂白增加，在控制变倍时应该谨慎。一般来说，成功的共聚焦成像是在获得合适的变倍系数和对样品成像时不会产生明显的光漂白（尤其是在做光学切片时）之间的折衷。
传统激光扫描共聚焦显微镜用于对细胞和组织成像时的主要缺点是，图像是通过栅格扫描样本获得的，这种扫描速度相对较慢，而且每幅图像通常需要几秒或更长的时间。在活细胞中，强激光照射标本产生也有很大的光毒性风险。在大多数情况下，激光束在样本上任何位置的停留时间只有几微秒。因此，激光激发能量必须足够高，以在停留时间内产生可用的信号，通常会导致位于光斑中的所有荧光团完全饱和。在这种情况下，会发生快速的光漂白。对于长时间的活细胞成像，应尽可能降低激光强度。使用激光扫描共聚焦显微镜进行活细胞成像的主要挑战在于降低光毒性的同时产生足够的对比度，尤其是在长时间成像的情况下。
转盘共聚焦显微镜
转盘共聚焦显微镜是基于振镜式的共聚焦显微镜的一种变形，它可以实时（每秒30帧）甚至更快地运行，在宽泛的时间范围内捕捉动态事件。转盘共聚焦显微镜的原理是基于一个不透明的Nipkow式圆盘，除了数以千计的钻孔或蚀刻针孔外，通常还覆盖着微型聚焦透镜，以交错的阿基米德螺旋模式排列。物镜将圆盘上每个被照亮的针孔在样品上成像为衍射极限的点。样品发射的荧光返回，通过Nipkow圆盘针孔后，可以被观察和记录（图7）。圆盘使得样品上的几千个点被同时照亮，实际上相当于同时获得几千张共聚焦图像。圆盘旋转会填充孔之间的空隙，并创建一个实时共聚焦图像，可以用裸眼直接观察，就像用标准的荧光显微镜一样。
Nipkow转盘的另一种变形是使用蚀刻有垂直狭缝而非针孔图案的磁盘提高光通量的方法，在保持可接受的共焦度的同时提供更大的光传输。与传统的Nipkow转盘不同，这些狭缝型圆盘的狭缝宽度不同，与不同物镜的数值孔径、放大率和样品厚度相匹配。因此，狭缝圆盘能够使用放大倍数从10倍到100倍的物镜以高分辨率获取共聚焦图像。这两种转盘设计主要是为活细胞成像应用而开发的，在增加图像采集速度的需求与轴向分辨率的轻微损失之间找到折衷（图8（c））。大多数转盘显微镜用激光或弧光灯光源照明，并与灵敏的电子倍增型CCD相机相结合，以便对微弱的荧光样品成像。
多光子显微镜
多光子显微镜中的激发是一个非线性过程，仅发生在显微镜衍射极限的焦点处，提供对厚的生物样品进行光学切片以获得三维分辨率的能力。通过栅格扫描X-Y平面上的样品获得单个光学截面，通过连续扫描序列轴向（Z）位置上的样品构成完整的三维图像，类似于共聚焦显微镜（产生光学截面）中的情况。由于焦点的位置可以精确地确定和控制，多光子荧光特别适用于探测样品表面下的特定区域。高度集中的激发能量有助于将位于焦平面的荧光团的光漂白作用减至最低，从而降低光毒性，提高样品的活性和随后研究活细胞和组织特性的实验持续的时间。此外，近红外激发波长在生物材料中有更深的穿透，并减少在较短波长下观察到的高度的光散射。这些优点使研究人员能够在厚的活组织样本（见图8（d））上进行实验，例如大脑切片和发育中的胚胎，这些样品很难用其他显微技术成像。
由锘海代理的布鲁克Ultima系列多光子显微镜，配备6mm剑桥振镜，可进行标准的栅格扫描，也可以自定义扫描；扫描视场达到1.404 mm X 1.404 mm （16x物镜，视场数高达28.3）；可选配8kHz共振振镜（30 fps（512 x 512））；最多可选择4个Hamamatsu Multi-Alkali PMT； 可升级为高灵敏度GaAsP PMT；可电动控制物镜角度和旋转；成像深度可达1.3mm
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