梅毒分子生物学实验诊断方法的研究进展
裴瑞青综述；曾铁兵，吴移谋审校
(南华大学病原生物学研究所，衡阳421001)
摘要：梅毒的临床表现十分复杂，诊断主要依靠实验室检测方法。传统的梅毒实验室诊断方法暴露出诸多缺点，本文综述了国外一些分子生物学技术用于梅毒实验室诊断的方法(以基因工程重组抗原的血清学方法和聚合酶链反应)的研究进展。
关键词：梅毒；重组抗原；PCR；分子生物学技术
中图分类号：R377 ．1 文献标识码：A 文章编号：1005—5673(2010)02-0075—04
梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)感染引起的慢性疾病，在性传播疾病(Sexxuallytransmitted disease，STD)中其危害性和致死率仅次于艾滋病，它还可垂直传播，严重影响婴幼儿健康。梅毒的临床表现极其复杂，诊断依据主要为实验室检测法，但传统的实验室诊断方法在特异性、敏感性、成本、自动化等方面均存在较多缺点。近些年来，随着现代分子生物学技术的发展，通过基因工程技术一系列重组Tp蛋白(rTp)被成功表达，基因诊断方法也不断更新。本文就国外以rTp为诊断抗原的Tp抗体检测方法及Tp基因诊断方法一聚合酶链反应(PCR)对梅毒的实验诊断进展作一综述。
1 基于rTp抗原的梅毒血清学方法的研究进展传统的梅毒血清学方法是检测非TP特异性抗体(反应素)和TP特异性抗体。前者主要有性病研究实验室玻片试验(VDRL)、快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)和甲苯胺红不加热血清反应素试验(TRUST)，其共同的主要缺点是生物学假阳性高，因此限于梅毒的筛查；后者主要有荧光密螺旋体吸收试验(FI'A—ABS)、Tp血凝试验(TPHA)、rrp明胶凝集试验(TPPA)及Tp微量血凝试验(MHATP)，所用诊断抗原为TP天然抗原，可用于梅毒的确诊。但TP尚不能人工培养，来源困难，加工和纯化复杂，易被兔睾丸组织污染，且与其它螺旋体存在共同抗原，因而试剂成本高，也存在一定的假阳性。通过基因工程可大规模获得重组抗原，大大降低了成本，降低交叉反应而提高了特异性。近年来TP的一系列重组抗原被成功地表达，目前所用的诊断抗原主要为重组蛋白Tp47、Tp15、Tp17、Tp44．5(TmpA)、Tp37等的2种以上的混合抗原(敏感性高于单一抗原)，这些重组抗原可被广泛地用于多种梅毒的诊断检测方法。
1．1 重组TP抗原酶联免疫吸附试验(rTP—ELISA)rTP．ELISA以重组抗原作为已知抗原，检测总特异性Tp抗体(主要为IgG和IgM)或特异性Tp抗体的类别(如IgG或IgM)。国外已有多种商业化的rTP．ELISA梅毒诊断试剂盒，主要包括ICE Syphilis(Murex，英国)、recomWell Treponema((Mikrogen，德国)(均以重组TpN15、TpN17、TpN47为诊断抗原)，INNO—uA Syphilis(Innogenetics，比利时)(以重组TpN15、TpN17、TpN47和合成肽TmpA为诊断抗原)、Enzywell TP(Diesse，意大利)、Bioelisa syphi—lis(Biokit，西班牙)以重组TpN15、TpN17为诊断抗原。现对这些试剂盒的简述如下：
Bruno[1 用5种以Tp裂解抗原和4种重组蛋白作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒(ICE Syph—ilis、Bioelisa Syphilis Trep—Chek、TmpA—ELISA Eurodiagnosfica，重组TmpA为诊断抗原)检测52份MHA—TP阴性的早期梅毒血清，19S IgM FTA—ABS(全TP为诊断抗原)和上述4种rTP—ELISA的灵敏度分别为90．4％ 、75．O％ 、67．3％ 、63．4％ 和48．5％ ，高于VDRL方法(44．2％)。同时以MHA—TP为参照，用ICE Syphilis和Enzygnost Syphilis(以Tp裂解物为诊断抗原)共对2 053份未知血清样本检测的特异性分别为99．5％ 和99．8％ 。-2 检测124份梅毒阳性样本，与TPHA比较，1]PPA、ICE Syphilis和Enzywell TP的符合率分别为96．7％ ，100％ 和99．1％ 。Viriyataveekul 用Enzygnost Syphilis、Syph—ilis EIA 480和ICE Syphilis检测3055份血清，与TPHA和／或FTA—ABS比较，特异性和灵敏度分别为100％ 和97．89％ 、100％ 和99．59％及99．1％ 和99．76％。Ebel【4 检测840份血清，与传统血清学方法比较，INNO—UA Syphilis试剂盒获得了99．6％特异性和99．5％灵敏度，认为可作为梅毒确诊试剂盒。Hagedom 检测的289份阳性血清、219份阴性血清和23份不确定血清，与TPHA和IgG—FTA．ABS的检测结果进行对照，INNO-uA Syphilis的灵敏度和特异性分别为100％和99．3％ ，认为该试剂盒比这两种传统方法可信度更高，是一种确诊梅毒的试剂盒。Sambri L6 检测了782份不同人群的血清，与以TP全细胞裂解物为诊断抗原的ELISA(Syphilis Screening)和MHA —TP试剂盒比较，recomWell Treponema试剂盒总的特异性为98．9％，灵敏度为98．3％ ，认为recomWell Treponema试剂盒在各期梅毒筛查中高度特异、敏感，是天然Tp诊断抗原ELISA检测的替代方法，尤其适用于TP—IgM检测。Young ¨将Enzywell TP和Syphilis ICE(初筛标准)比较，两者特异性相似，灵敏度相似且高于I；TA·Abs，与Ⅱ’PA相当，认为Enzywell TP是一种简便、高度特异和敏感的梅毒诊断方法。Ebel 用Bioelisa syphilis试剂盒检测434份TPHA和FrAabs阳性的血清，显示出99．5％的灵敏度和99．4％的特异性，认为这是一种灵敏、特异、快速的试剂盒。Dommelen-9 检测145例TPPA阳性、41例健康阴性对照和144例嗍阴性血清，Bioelisa syphilis与ETI—Treponema Plus(Diasorin S。P．A．，西班牙)试剂盒都有100％特异性和100％灵敏度，远高于一步法免疫层析法(Biorapid Syphilis)。
大量的临床评价表明，rTP-ELISA方法具有特异性和灵敏度高、成本低，操作简便、结果客观准确、实验室设备要求低等优点，适合大批量血源筛选和临床梅毒病人的确诊，若检测特异性IgM，还可作为梅毒复发感染、疗效判断及区分母体梅毒和先天性梅毒胎儿的重要依据 J，被公认为是梅毒血清学诊断的首选方法¨引。目前所用抗原是上述5种重组抗原中2种以上的混合抗原，近年来也有将多个基因构建在同一个载体来表达的重组融合蛋白作为诊断抗原，如rTPN15—17-47 。1．2 重组抗原蛋白印迹法(Immunoblotting或West—em blot．WB)
WB结合了免疫学和分子生物学的特点，敏感度与特异性均很高，是国际上公认的确认试验中的“金标准”。Sambri¨ 对五种重组抗原(TpN47、Tm—pA、TpN37、TpN17和TpN15)进行WB(recWB)，检测450份血清标本中TP—IgG，与全细胞裂解抗原免疫印迹法(wclWB)和MHA—TP进行了对比。结果显示，rTmpA最高检出(95％)，其余从高到低依次分别为rTpN4(92．5％)、rTpN17(89．5％ )、rTpN15(67．5％)和rTpN37(41％)；recWB与MHA—TP的一致率为95．0％ ，与wclWB 的一致率为97．5％；以MHA—TP为参照，recWB的灵敏度与特异性均高于wclWB法。认为recWB可作为wclWB检测的替代方法。目前已有多种recWB的商品化试剂盒，如IMMO-Lia Syphilis Score(Immuno genetics，比利时)、RecomBlot Treponema IgG／IgM (Mikrogen，德国)。与常规WB不同，这些试剂盒已预先将重组抗原分离在试剂条不同位置上，与待测特异性IgG或IgM结合后通过酶反应显示条带，由于不需电泳，因而操作十分简便。Frigo¨ 用IMMO—Lia Syphilis Score检测224份血清，显示出100％灵敏度和98％特异性及100％重复性，是传统检测方法的补充。Kotnik_1 等用该试剂盒检测26份三期可疑神经性梅毒患者血清和脑脊液中特异性Tp—IgG，与传统检测方法比较，能检测静止期和活跃期神经性梅毒脑脊液内IgG，是新一代检测脑脊液中特异性Tp抗体的方法。商品化的recWB高度特异、灵敏、重复性好，简便快捷，结果判断客观，是目前常用的梅毒确诊方法。
1．3 重组抗原免疫层析法(Immunochromatographyassay，1CA)基于Tp重组抗原的免疫层析法是近几年发展的一种十分简便、快速的梅毒初筛血清学方法，适用于性病门诊的快速检测、街头无偿献血者的筛查以及紧急用血。Sato¨副评价了商品化免疫层析试纸条(ItS)(Determine Syphilis TP，Abbott Lab．)，认为这是一种快速简便、敏感特异的梅毒筛查方法，适用于边远地区健康机构。Montoya 检测4789名孕妇标本，比较了ICS和RPR的精确度，以金标准作为参照，结果显示在实验室ICS的灵敏度为95．3％ ，而在健康机构检测则为841％ ，RPR为70．7％。其特异性和阳性率二者则相当。Nessa【17]用ICS检测684份女性性工作者，与金标准方法相比较，灵敏度为94．45％ ，特异性为92．6％ ，且于随行医务人员和实验室专业人员中的检测结果无显著性差异，认为这是一种非侵袭性的梅毒快速筛查方法。免疫层析法虽然快速简便，但Dommelen 用一步法免疫层析试剂盒Biorapid Syphilis和两种ELISA 试剂盒(Bioelisa Syphilis 3．0和ETI—Treponema Plus)作比较，灵敏度92％ 和特异性79％ 均明显低于ELISA检测的均为100％ ，认为Biorapid Syphilis适于健康结构筛查而不适于医院实验室梅毒检测。
1．4 重组抗原化学发光法(Chemiluminescence as．say，CHA)
CLIA是一种新型的定量、高度自动化的梅毒检测方法。Marangoni-】 对重组Tp17的CLIA(LIAI—SON Treponema Screen，DiaSorin，意大利)进行了评价，其灵敏度99．2％仅次于recWB100％ ，明显高于EIA 95．4％ 和TPHA 94．7％ ，特异性都达到了99．9％，认为CLIA是一种高度特异、敏感和自动化的梅毒筛查方法。Knight【19 3评价了LIAISON Tpallidum-specific assay(Diasorin，MN)，与CAPTIASyphilis—G EIA比较，结果表明该方法在梅毒初筛和确诊检测中都是一种非常敏感、特异的方法，适合于各种人群。Donkers 以重组Tp17的CLIA(IMMU—LITE 2000Syphilis Screen，美国)检测681份孕妇标本作的评价，其灵敏度比bioelisa SYPHILIS 3．0(ELISA法)更高，认为CLIA比ELISA更为特异和敏感。CLIA检测成本高，需要特殊昂贵设备，目前尚难以普及。
2 梅毒的PCR诊断方法
血清学方法是梅毒实验室主要诊断方法，但对极早期感染梅毒及特殊类型的梅毒灵敏度较低，而直接检测Tp的暗视野显微镜、免疫荧光染色等方法敏感性和特异性都较低。PCR方法是梅毒诊断常用的高度特异、敏感的分子生物学方法，在检测早期梅毒、免疫功能低下的梅毒(如伴艾滋病梅毒)、先天性梅毒、神经性梅毒及判断再感染和复发、区分其它螺旋体感染等方面有十分重要价值l2¨。目前PCR检测Tp主要的靶基因有TP47、polA、16SrRNA、tpf一1、BMP、tmpA和tmpB等 J，以TP47和polA的特异性最高。选择PCR诊断梅毒需要考虑患者所处的梅毒病程阶段和样本来源，以一期和二期梅毒的溃疡和皮损拭子最为适宜，其它样本如全血、脑脊液、羊水、活检样本、石蜡包埋组织也可作为待检样本，但灵敏度较低，需待进一步评价 ]。PCR类型有常规PCR、RT—PCR、巢式PCR、多重PCR(可同时检测多种溃疡样本的病原体)、实时荧光定量PCR(rea1．time PCR)、多重实时荧光定量PCRL2 等。其中real—time PCR目前在实验室诊断梅毒中较为常用，具有特异、灵敏、自动化、重复性好和可定量等优点，其主要的靶基因是TP47 L25]和po一1A[26]。 PCR检测Tp主要缺点是假阳性较高、灵敏度受来源样本和所处病期的限制、试剂盒成本较高、实验室条件高、需特殊仪器，目前尚只能作为血清学方法的补充方法。
3 小结
血清学方法仍然是梅毒实验室诊断的主要方法，以重组抗原作为诊断抗原的特异、灵敏、快速、简便、低成本的血清学方法是发展趋势，目前ELISA方法较为常用，适用于医院内大批量血液的筛查，也可用于确诊，而ICA适用于性病外展服务以及基层诊疗服务机构的快速筛查。WB和CLIA灵敏度和特异性都很高，可用于梅毒确诊。但目前重组抗原仍不能检测各期梅毒，需要进一步评价其它新的重组抗原在梅毒诊断中的意义 。PCR方法作为血清学方法的有效补充，适用于早期梅毒、胎传梅毒、神经性梅毒及体液免疫功能低下等特殊类型的梅毒，但引物的特异性和灵敏度仍待提高。
参考文献：(略)
