人CGMP ELISA Kit使用说明（一）
预期用途
此酶免试剂盒用于细胞裂解液，组织，血浆和尿液中cGMP的定量检测
实验原理
此试剂盒采用的竞争酶免法，游离的cGMP和乙酰胆碱酯酶标记的cGMP共同竞争结合位点上一定量的cGMP特异性兔抗。由于标记的cGMP量不变，随着游离的cGMP的不同，标记cGMP与兔抗结合，结合的量与孔内游离的cGMP浓度成反比。兔抗-cGMP复合物再与预先包被在微孔板内的鼠单抗抗兔IgG结合，洗板洗去未结合的复合物，然后加入底物显色液，反应液有明显的黄色并在412nm处有强吸光度值，显色强度与结合的标记cGMP浓度成正比，而与游离的cGMP成反比。
试剂盒组成
编号 | 成分 | 96孔 | 480孔 |
481022 | 抗血清 | 1支 | 1支 |
481020 | 乙酰胆碱酯酶 | 1支 | 1支 |
481024 | 标准品 | 1支 | 1支 |
400060 | 缓冲浓缩液（10X） | 2支/10ml | 4支/10ml |
400062 | 洗涤缓冲浓缩液（400X） | 1支/5ml | 1支/12.5ml |
400035 | 吐温20 | 1支/3ml | 1支/3ml |
400004 | 鼠抗兔IgG包被板 | 1块 | 5块 |
400012 | 盖板 | 1块 | 5块 |
400050 | Ellman’s试剂 | 3支/100dtn | 6支/250dtn |
400031 | 无水醋酸 | 1支/2.5ml | 1支/12.5ml |
400029 | KOH | 1支 | 1支 |
400040 | 示踪染料 | 1支 | 1支 |
400042 | 抗血清染料 | 1支 | 1支 |
实验所需材料但试剂盒未提供
1. 酶标仪 405-420nm
2. 可调节的移液管和可重复使用的吸量器
3. 超纯水
4. 用于样品准备的其它器材
储存条件和稳定性
此试剂盒需按指定要求储存于-20℃,并在有效期内使用,有效期见盒外
实验前准备
缓冲液制备
所有缓冲液贮存在4℃至2个月
EIA缓冲液准备
将1支EIA缓冲液(编号:400060)加90 ml超纯水进行稀释.确保冲洗掉瓶内盐类沉淀物.
洗涤液准备
用2L的超纯水稀释5 ml400倍浓缩的洗涤液(96T试剂盒,编号:400062),同时加入1 ml吐温20(编号:400035) 或者 用5L的超纯水稀释12.5 ml400倍浓缩的洗涤液(400T试剂盒,编号:400062), 同时加入2.5 ml吐温20(编号:400035)
提示:由于吐温20是粘性液体,所以不能用常规的移液管移液.需用位移移液管与注射器进行定量.
样品准备
一般情况下，尿液和组织上清液可用缓冲液稀释，然后直接加入微孔内。血浆，血清，全血和组织匀浆和其他非均匀的基质可能会含有感染实验的杂质，在进行大量样品检测时最好是先进行干扰检查。进行干扰检测试验时，稀释1到2个检测样品，每个样品两个不同的稀释比例，如果在最后的cGMP浓度计算中两个不同稀释比例的样品具有良好的相关性，则不需纯化，否则需进行纯化。由于多数样品中都会含有磷酸二酯酶，样品纯化强制酶对cGMP的水解。
血浆（血清）纯化
500ul的血浆加上2ml的冰乙醇混匀，室温下放置5min，1500xg下离心10min以除去沉淀，将上清移至另一10ml的干净试验管。在真空离心机中或者氮气气流中干燥上清液，然后再加入500μl的EIA缓冲液溶（离心机能用来干燥提取物中的水分），确保所乙醇已经除尽以免微量的乙醇影响检测结果。
培养基样品
组织和细胞上清无需纯化可直接用于试验。如果样品中的cGMP浓度足够高则需用缓冲液进行10倍的稀释，试验操作无需进行任何改动。当样品低浓度时（样品无需缓冲液稀释），稀释同一培养基中的标准曲线，以达到样品和标准品基质达到相符合。我们建议要首先建立标准曲线以确保在特殊的样品中试验也可进行。
细胞液抽提
1. 提出培养基
2. 每35cm2表面区域加入1ml的0.1M的盐酸
3. 室温下孵育20min
4. 用刮刀将细胞从表面刮落
5. 用移液枪吹打混匀直至上清均匀，转移至合适的离心管内
6. 1000xg
这些上清可直接用于试验
组织样品
7. 组织中的循环核苷酸会立即分解，所以下离心10min
1. 上清倒入另一干净试验管内采样后应将其立即冰冻
2. 冰冻组织称量，滴加5-10个单位（液体/ml，组织/g）的TCA,用匀浆器将样品混匀。
3. 1500xg下离心10min，去除沉淀，将上清移至另一干净试验管
4. 用水-饱和乙醚从样品中抽提TCA。5体积的乙醚和1体积的上清，混合10秒，萃取分离，去除上层，重复抽提两次以上。
5. 通过在70℃下加热样品以除去剩余的乙醚。
组织中提取的上清无需稀释可直接用于试验，标准曲线基质液的准备，抽提10ml 用乙醚处理过的5%的TCA，通过加热除去剩余的乙醚，剩下的溶液检测得标准曲线。
