从RNA抽提到电泳鉴定-2
逆转录（RT）
一，准备工作
1， 实验器具与材料：
（1）移液枪：200ul、10ul
（2）吸头：200ul、20ul
（3）EP 管1.5ml、100ul
（4）水浴箱
2，实验器具的处理与准备
塑料制品：（包括吸头、EP管等）
将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
3，试剂配制和准备：
（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。
（2）RT中所需要的各种试剂
（3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量×X）
二，RT 时注意事项：
为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三，RT步骤
用 SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）
1， 准备0.65ml的EP管
2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。
3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。
5， 短暂离心
6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。
7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8， -20℃保存，或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）
1， 准备0.65mlEP管
2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA
3， 稍离心，100℃沸水裕1min
4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶
5， 稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT
6， 100℃沸水裕3min灭活AMV
7， 立即PCR或-20℃保存。
聚合酶链式反应（PCR）
二，准备工作
8， 实验器具与材料：
（1）移液枪：200ul、10ul
（2）吸头：200ul、20ul
（3）吸头台：放置200ul和 20ul的吸头一个
（4）EP管1.5ml、100ul
2，实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。
3, 试剂配制和准备：
(1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。
(2) PCR中所需要的各种试剂
三，PCR 时注意事项：
佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
四，PCR步骤
1， 准备100ul EP管
2， 依次在管中加入：（50ul反应体系）
ddH2O 37.5ul ×？
10mM dNTP 1ul ×？
10×PCR buffer 5ul ×？
25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？
上游引物 1ul ×？
下游引物 1ul ×？
模板cDNA 1ul
