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2020版《中国药典》三部--生物制品国家标准物质制备和标定

2021.12.01

　　生物制品的生产通常以微生物或人/动物源的细胞、组织和体液等为起始原材料，其制备过程或制剂中可能添加人或动物来源的原材料或辅料，这些起始原材料、原材料或辅料潜在的病毒污染是影响产品安全性的关键因素。

　　本通则是对生物制品病毒安全性控制的基本要求，旨在控制生物制品的病毒安全性风险，保证产品质量。本通则适用于本版药典生物制品定义范围的相关产品。涉及与传染性海绵状脑病（TSE）等相关的传染因子，还应符合国家其他相关法规要求。

　　—、病毒安全性控制的一般原则

　　（一）风险评估

　　生物制品理论上都存在病毒污染的潜在风险，但不同类型的生物制品在来源、潜在污染病毒的特性、生产工艺及临床应用的给药方式和适用人群等方面的不同，导致其病毒安全性风险大小存在差异。因此，生物制品的病毒安全性控制要求，应建立在风险评估的基础上结合产品特点综合考虑。

　　（二）全过程控制

　　生物制品病毒安全性控制应体现在生物制品质量控制的全过程。其基本要素包括对生产过程使用的相关物料（起始原材料、原材料和辅料）的来源控制、病毒污染筛查或处理，生产工艺对病毒的清除作用，以及对产品（包括中间产物和成品）病毒污染的检测。

　　（三）全生命周期管理

　　生产工艺变更对病毒清除的影响应加以评估，根据影响程度，对病毒清除步骤进行必要的确认或再验证。必要时还应通过上市后监测追溯产品病毒安全性，保证生物制品全生命周期的病毒安全性控制。

　　（四）不同类别生物制品病毒安全性控制要点

　　1. 人血液制品

　　人血液制品起始原材料为健康人血浆，存在经血传播病毒的安全性风险，人血液制品的病毒安全性控制应包含生物制品病毒安全性控制的所有要素，重点应考虑人血浆来源的病毒风险控制和生产工艺过程的病毒清除能力，必要时应实施对上市产品病毒安全性的追溯。

　　2. 动物体液/组织来源制品

　　动物体液/组织来源制品的病毒污染最大风险来源于起始原材料。重点应考虑起始原材料的动物病毒特别是人畜共患病毒的风险控制，以及生产工艺过程的病毒清除能力，必要时应对产品进行病毒污染的检测。

　　3. 疫苗

　　疫苗制品的病毒安全性控制以对起始原材料、原材料和辅料的病毒污染来源控制为主，主要包括病毒污染的检测和筛查。采用非重组技术生产的灭活疫苗，其生产工艺中针对目标病毒的灭活处理和验证应按具体品种的相关要求执行；采用重组技术生产的疫苗还应符合重组治疗性生物制品的相关要求。

　　4. 重组治疗性生物制品

　　重组治疗性生物制品的病毒安全性控制应在风险评估的基础上，重点考虑对工程细胞基质、工程菌、原材料和辅料的病毒污染来源进行控制。采用动物细胞表达的重组治疗性生物制品还应重点考虑生产工艺过程的病毒清除能力。

　　5. 基因治疗产品

　　基因治疗产品的病毒安全性控制应在风险评估的基础上，重点考虑对细胞基质、菌毒种、原材料和辅料的病毒污染来源进行控制。采用病毒为载体的基因治疗产品，还应建立与病毒载体特性及生产工艺特点相适应的病毒风险评估和控制要求，如对非复制型病毒载体生产工艺应关注产生复制型病毒的风险和控制，复制型病毒载体生产应关注产生野生型病毒的风险和控制，生产过程中使用辅助病毒的，应评估和验证生产工艺对辅助病毒的清除能力。如可行，应评估病毒载体纯化工艺对相应病毒的清除能力。

　　二、病毒安全性控制的具体要求

　　（一）来源控制

　　1. 起始原材料

　　生物制品的起始原材料主要包括生产用细胞基质、菌毒种、血液制品生产用原料血浆和动物体液/组织，应分别符合 “生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制” “生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制” “血液制品生产用人血浆” “人用马免疫血清制品总论” 及 “生物制品生产及检定用实验动物质量控制（通则 3601）” 的相关要求。

　　人血液制品生产用原料血浆病毒安全性控制，应重点考虑供血浆者的筛查、单份血浆和合并血浆的病毒检测。

　　源自动物组织或体液的生物制品，如动物来源的免疫血清、体液或器官等，应控制动物的来源并实施检疫/检疫期管理，不得使用来自疫区的动物，保持动物的清洁卫生，发现存在健康隐患的动物，应及时处理或予以淘汰。

　　2. 原材料及辅料

　　应符合 “生物制品生产用原材料及辅料质量控制” 的相关要求。应尽可能选择无病毒安全性风险或低风险的原材料和辅料用于生物制品生产，如选择采用重组技术生产的生物材料替代动物源性生物材料，或采用化学材料替代生物材料。

　　（二）生产过程控制

　　1. 产品生产工艺

　　生物制品生产过程包含的理化工艺步骤可能具有一定的病毒清除作用，通过工艺开发和验证可证明生产工艺对于潜在病毒污染的整体清除作用。由于产品制备工艺通常会在工艺参数允许的范围内变化，可能导致其病毒清除作用难以控制在恒定水平，因此，应明确影响病毒清除效果的关键工艺参数及控制范围，并在此基础上建立充分的产品制备工艺过程的控制策略。当产品制备工艺不足以达到有效清除病毒、控制产品病毒安全性的目的时，应增加特定的病毒清除工艺步骤。

　　2. 特定病毒清除工艺步骤

　　特定病毒清除工艺步骤是在生物制品生产过程中为去除/灭活潜在污染病毒而加入的，这些步骤可能不是产品制备或纯化所必需的。

　　根据潜在污染病毒的特性，结合产品特性和生产工艺、病毒清除工艺的作用机制和清除能力的综合评估，选择适宜的病毒清除工艺（包括作用机制的选择，以及单一或组合工艺步骤的选择等）。病毒去除/灭活工艺效果应经过验证并符合相关要求。

　　对于特定的病毒清除工艺步骤，应明确影响病毒清除效果的关键工艺参数以及相应参数设定范围对病毒清除效果的影响。某些特定的病毒清除工艺步骤可能会对生物制品活性成分产生影响，如活性成分的降解/聚合或结构改变等，因此应根据病毒清除工艺对产品质量的影响情况进行综合评估，选择适宜的病毒清除方法，明确病毒清除工艺步骤涉及的中间产物的关键参数，如蛋白质浓度、pH 值等，并评估病毒清除步骤对产品关键质量属性的影响。

　　（三）产品病毒污染的检测

　　1. 病毒污染检测设置的原则

　　病毒污染检测结果的准确性和可靠性与污染来源、污染病毒的特性、生产工艺步骤等密切相关，某些情况下因未加工粗品（未经任何纯化工艺步骤处理的初加工合并物，如扩增或发酵产物，或经过一次或多次回收/分离提取后集中起来的生物材料，如混合血浆、混合的抗血清等）可能具有细胞毒性作用，或污染病毒随着生产过程中的某阶段中间产物的部分加工处理而失去活性，从而影响病毒检测结果，因此，应综合上述因素确定对生产过程中最适阶段的中间产物或成品进行取样和检测，以及应检测病毒的种类、频率和方法。

　　通常，检出外源病毒污染的中间产物不能用于进一步加工制备，成品不能放行，同时应查找并确认污染来源，采取适当的防控措施。

　　2. 病毒污染检测方法的选择

　　应结合品种特点和具体生产情况的综合分析，设计并选择适宜的方法对潜在污染病毒进行检测，如细胞培养法、核酸扩增技术等。为提高病毒检岀率，应尽可能采用先进的技术和方法用于病毒污染的检测。病毒检测阴性不能完全证明无病毒污染存在，应排除因取样量不足、病毒含量低于检测方法的灵敏度，或检测方法不适用等导致病毒检测结果阴性的情况。

　　（四）病毒清除工艺验证

　　病毒清除工艺验证（采用指示病毒以评价生产工艺过程病毒去除/灭活能力的验证）的目的是证明实际生产过程对病毒去除/灭活的有效性，并对病毒的整体降低水平作出定量评估。

　　病毒清除工艺验证通常是在非生产现场的特定实验室进行，在缩小规模的情况下，通过将一定量的指示病毒（在病毒去除/灭活工艺验证研究中使用的用于显示工艺处理效果的感染性活病毒）加入起始原材料或生产过程某阶段的中间产物中，模拟实际生产工艺参数及控制条件下的处理过程，然后取样测定经处理后产品中的残留指示病毒，以证明经过该特定工艺处理后指示病毒的去除或灭活已达到相关规定的要求。

　　1. 一般要求

　　（1）指示病毒的选择

　　应尽可能选择对人类没有致病力、与潜在污染病毒相似且易于体外培养、适合具体产品特性及工艺特点、对验证工艺具有耐受性的病毒作为指示病毒，指示病毒可分为“相关”病毒（用于生产过程中评价病毒去除情况的病毒，可以是已鉴定过的病毒或是与已知病毒种类相同的病毒，或是生产过程中使用的任何易污染细胞培养物或污染其他生产用材料、试剂的病毒）、特异 “模型” 病毒［与已知病毒或可疑病毒密切相关（同种或同属）的病毒，并与所观察到的或可疑病毒具有类似理化特性的病毒］和非特异 “模型” 病毒（用来为生产工艺去除病毒能力定性的病毒，其目的是对生产过程去除/灭活病毒的总体能力进行定性，即确定纯化工艺的能力）三类，应优先选择与潜在污染病毒密切相关的病毒，如相关病毒不能获取或不适于体外培养（如不能离体培养到足够高的滴度），可采用特异 “模型” 病毒代替；评价病毒清除的总能力时，应选择具有不同特性的非特异性 “模型” 病毒，包括 DNA/RNA、有/无包膜、颗粒大小、尤其对物理/化学处理明显耐受的病毒等。此外，还应考虑指示病毒的实验毒株与自然毒株及其他毒株之间可能存在的差异，在其他特性相同的前提下应优先选择抵抗力强的毒株（病毒清除工艺验证常用指示病毒示例及相关属性见表 1）。

　　（2）常用特定病毒清除工艺

　　病毒清除工艺的清除能力可能具有病毒种属特异性。因此需要在风险评估的基础上，结合可能污染病毒及产品的特性进行综合考量，选择合适的特定病毒清除工艺。常用的特定病毒清除工艺包括巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂（ S/D ）处理法、膜过滤法、低 pH 孵育法、色谱法等。

　　（3）验证方案的设计

　　①病毒清除验证研究是在缩小规模的体系中进行，其每个因素应尽可能反映实际生产过程中的情况，并阐明其合理性。例如色谱工艺步骤的柱床高度、线性流速、流速/柱床体积比、缓冲液、填料类型、pH、温度、蛋白质浓度、盐浓度及目标产品都应代表规模生产水平，洗脱曲线应具有类似性。此外，由于色谱柱对病毒的清除能力可能会随着色谱柱重复使用而发生变化，因此，应评估多次使用后病毒清除的稳定性。对于其他工艺步骤，应使用类似的理念。验证工艺和实际生产情况的差异是难以避免的，应分析这种差异对验证结果的影响。

　　②如生产工艺中包含两步或两步以上病毒清除工艺步骤，应分别进行病毒清除效果验证，以确定单个生产工艺步骤的清除作用和多个生产工艺步骤的综合清除作用。

　　③应明确病毒清除的机制，并依据病毒特性选择适宜机制的病毒清除工艺。用于病毒清除验证的指示病毒的初始滴度应尽可能高，使指示病毒以较小的体积加入待测产品中，以避免加入病毒引起稀释效应或者改变产品的性质。在灭活工艺中，通过病毒灭活动力学（包括病毒灭活速率和灭活曲线）研究结果的评估，可获得确切的病毒灭活效应。

　　④验证样品的各成分含量和理化特性应与规模生产的产品尽可能一致，在此基础上评估影响病毒清除效果的工艺参数变化范围，以及清除工艺的稳定性。确定对清除效果影响最大的条件/最差条件进行验证。

　　（4）验证影响因素的考虑

　　①验证用指示病毒的制备制备验证所用病毒应避免病毒聚集，高滴度病毒易出现聚集，可能影响工艺对病毒的去除和（或）灭活效果，从而使验证结果与实际生产情况不符，导致对实际病毒清除工艺效果的误判。

　　②取样过程验证过程中每步取出的样品应尽快并尽可能直接进行病毒测定。如果样品必须做进一步处理（如超离心、透析或保存、除去抑制剂或毒性物质等），或不同时间取出的样品要放置一定时间等待同一时间点进行测定，这种情况下应进行平行对照分析，以确定样品在进行病毒滴度检测前经历的上述处理过程不会使病毒失去感染性，从而影响病毒滴度的检测结果。

　　③干扰因素应评估缓冲液和产品自身对指示病毒的毒性作用或对病毒滴度检测方法的干扰作用，必要时采取适当措施，减少对病毒清除工艺效果的评估产生影响。

　　2. 用于病毒清除研究的检测方法

　　应尽可能选择灵敏度高的病毒检测方法，以确保对灭活效果的准确判定。用于病毒清除研究的检测方法应经评估，评估包括灵敏度、特异性、重复性、缓冲液/基质对病毒感染力的干扰、可能影响选用指示病毒对细胞感染能力的产品及缓冲液的细胞毒性分析等。

　　常用病毒检测方法可采用病毒含量或滴度检查（包括蚀斑形成试验和细胞病变法）或定量病毒核酸检测相关技术。

　　3. 病毒清除效果的评估

　　通常采用指示病毒的清除下降因子评估病毒清除效果。此外，由于病毒灭活过程通常不是简单的一级反应，一般是起始反应速率快，其后变慢，在不同的时间点取样检测病毒感染性并建立病毒灭活动力曲线可更好地显示病毒灭活的效果。

　　病毒清除验证是通过跟踪检测指示病毒感染性/病毒量的变化进行评估的，应选择能够准确反映指示病毒信息的关键点进行病毒清除验证的设计、实施及分析，从而达到可靠地评估清除步骤去除/灭活病毒能力的目的。

　　（1）病毒清除下降因子的评估

　　病毒清除下降因子（指经过生产工艺步骤处理后，指示病毒感染量被去除/灭活的程度）用生产过程病毒清除步骤前后的病毒量（滴度）减少比例的常用对数来表示。整个生产工艺的总病毒清除下降因子一般为单一清除步骤的病毒清除下降因子之和。制品的整体工艺病毒清除下降因子通常应远大于最终产品的单次使用量的起始原材料中存在的假定病毒量。

　　（2）病毒清除下降因子的计算

　　病毒清除下降因子可以通过以下公式计算。

　　式中 R为病毒清除下降因子；

　　V1为起始样品体积；

　　T1为起始样品的病毒滴度；

　　V2为最终样品体积；

　　T2为最终样品的病毒滴度。

　　在计算病毒清除下降因子时，以指示病毒与样品按一定比例混匀后零点取样测得的基础滴度为起始样品的病毒滴度；如上述情况不适用，则按加标病毒溶液的病毒滴度为起始病毒滴度进行计算。

　　（3）评估结果的说明

　　病毒清除下降因子（log10）≥ 4 logs，表示该步骤去除/灭活病毒有效；如因检测方法导致病毒清除下降因子＜4 logs时，应盲传三代，如无病毒检出，可认定是有效的病毒清除方法。一般情况下，病毒清除下降因子≤1 log 的，不应作为病毒清除步骤。

　　需要强调的是，病毒清除下降因子对数减少值不能作为病毒清除步骤有效性的唯一或绝对指标。对病毒清除工艺有效性的评估，应综合考虑相关因素，如指示病毒的适合性、病毒清除研究的设计、有效步骤或整体工艺病毒清除下降因子、灭活速率、清除工艺的影响因素、病毒检测方法的灵敏度等。

　　4. 统计分析

　　病毒清除研究中，应采用适宜的统计处理方法进行分析，特别是有关病毒含量的正确估算，以支持得出的结论。

　　（五）生产工艺变更对病毒清除的影响

　　生产工艺变更可能影响前期已确认的病毒安全性评价结果，应评估这种变化对病毒清除的直接和间接影响，根据影响程度，对病毒清除步骤进行必要的确认或再验证。

　　三、上市产品的病毒安全性追踪

　　产品上市后的追踪观察，是确认生物制品病毒安全性的直接证明。应定期对产品潜在病毒的污染进行回顾性追溯，采用适宜方法监测针对产品的可能污染的病毒，实现上市后产品病毒安全的可追溯。随着新的检测技术的应用以及上市产品使用范围进一步扩大，如发现新的病毒，应及时进行分析和评估，并制定新的产品病毒安全性控制策略。