抗生素抗性基因检测实验操作步骤
本文以客户的案例为背景,介绍了实时荧光定量PCR法检测抗生素抗性基因的所需的试剂耗材以及详细的实验操作步骤。
实验摘要
以目的DNA为模板,PCR扩增获得目的片段,进行TA克隆。提取质粒,单酶切线性化,进行梯度稀释获得一系列不同浓度的标准品。通过 实时荧光定量PCR ,采用SYBR GREEN染料法,对样品进行绝对定量。
1.试剂与耗材
试剂与耗材
样品:45例土壤样品。胶回收试剂盒,美国Axygen公司,AP-GX-50。
2×Taq PCR MasterMix,南京钟鼎生物技术有限公司,PC16-1。SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒,北京艾德莱,DN27。
SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus),Bµlk,宝生物工程(大连)有限公司,RR820L。Hind III,宝生物工程(大连)有限公司,1060A。
EcoR I,宝生物工程(大连)有限公司,1040A。pMDTM19-T Vector Cloning Kit,宝生物工程(大连)有限公司,6013。
Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit,北京艾德莱生物有限公司,CV1401。DL2000 DNA Plus Marker(100、250、500、750、1000、1500、2000 bp),南京诺唯赞生物技术有限公司,MD101。
1Kb DNA Ladder Marker(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 kb),南京诺唯赞生物技术有限公司,MD105-01。GelStain,北京全式金生物技术有限公司,GS101-01。
Agarose,西班牙Biowest公司,91622。离心管,美国Axygen公司,311-01-051。
枪头,美国Axygen公司。其它试剂均为国产分析纯。
2.主要实验仪器
试剂与耗材
荧光定量PCR仪,杭州BIOER,Lightcycle K。基因扩增梯度PCR仪,杭州博日,TC-96/G/H(b)C。
台式高速冷冻离心机,美国BECKMAN公司,Allegra 21R。电子天平,美国AHOMS公司,AR5120。
恒温水浴锅,美国Amersham Pharmacia公司,MultiTemp III。紫外透射仪,美国Amersham Pharmacia公司,Hofer MV-25。
雪花状制冰机,日本SANYO公司,SIM-F140AY65。移液器,德国Eppendorf公司。
单人单面(垂直送风)洁净工作台,苏州苏洁净化设备有限公司,SJ-CJ-1FD。
3.抗性基因检测实验步骤及结果
3.1.DNA提取
提取步骤参见SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒说明书。
3.2.DNA扩增
PCR反应体系如下:
PCR反应体系如下:
3.3.TA克隆
pMDTM19-T Vector Cloning Kit,宝生物工程(大连)有限公司,6013。
Zero Background pTOPO-TA Cloning Kit,北京艾德莱生物有限公司,CV1401。
(1)将上述PCR产物切胶回收后,在PCR管中配制下列溶液:
(2)室温(20℃-30℃)连接5 min。
(3)取100 µL感受态细胞,置于室温解冻,完全解冻后轻弹几次将细胞均匀悬浮。
(4)加入连接产物,轻轻混匀,室温放置5min。
(5) 向离心管中加入500 µL不含抗生素的LB培养基,混匀。37℃,200 r/min,30 min。
(6)吸取复苏后细菌,均匀涂在含Amp的琼脂培养基上。37℃,倒置待平板吸收全部菌液,过夜培养。
(7)挑取阳性单菌落,PCR检测,并送样测序。
3.4.标准曲线的制作
(1)将阳性菌株,接种到含氨苄抗性的LB培养基中,37℃ 200 r/min,摇菌过夜。
(2)提取质粒,通过单酶切后,回收酶切产物。
(3)测浓度,计算拷贝数,制成标准品。
3.5.荧光定量PCR
反应体系的配制(总体积20 μL):
荧光定量PCR扩增条件的设置:
扩增曲线:94℃ 30 s;94℃ 10 s,60℃ 12 s,72℃ 30 s循环45次,72℃单点检测信号。
溶解曲线:95℃ 0 s,65℃ 15 s,95℃ 0 s,连续检测信号。
3.6.实验结果