高内涵成像技术在网络集成式细胞内特征的......（二）
图3 单细胞耗氧率动态代谢检测及分析
一步染色法检测细胞对药物的敏感性
应用ImageXpress® Micro高内涵成像系统可快速、方便、高通量的测量细胞对小分子药物的多参数生理变化，并且使用三种荧光染料对活细胞进行染色，只需一步，无需清洗，对于贴壁性不好的有丝分裂细胞和凋亡细胞，这种方法比传统的基于免疫荧光染色的方法更加准确。应用此法得到的数据已经上传到NIH的LINCS公共数据库中(http://lincs.hms.harvard.edu/)。
在传统免疫荧光法和一步荧光染料法的对比实验中，免疫荧光法用phospho(Ser10) Histone H3标记有丝分裂细胞，antcleaved PARP1标记凋亡细胞。染料法用LysoTracker-Red显示细胞形态，DEVDNucView488 caspase-3标记凋亡细胞。两种方法均用Hoechst 33342标记细胞核。免疫荧光法是将细胞固定后进行抗体染色步骤，包括冲洗板子，而荧光染料法是染色后再固定细胞，并且在采集图像前没有冲洗的步骤。
实验中用典型的抗有丝分裂药物紫杉醇处理人膀胱癌5637细胞（图4）。在无药物的对照组，这两种实验方法的结果十分相近，包括细胞密度、细胞核形态、%有丝分裂、%凋亡细胞。在紫杉醇处理24小时后，两种实验方法中的有丝分裂细胞数均显示出明显增加。但是，凋亡细胞数在免疫荧光法中明显少于荧光染料法。这说明免疫荧光法冲洗板子的过程虽然可以有效的保留有丝分裂细胞，但会使凋亡细胞损失。为了证明这一结论，我们用紫杉醇处理细胞48小时后，用荧光染料法染色，先按正常程序不冲洗，采集下图像后，再用PBS冲洗三次模拟免疫荧光法，采集同样位置的图像，冲洗前后的图像对比如图4C所示。冲洗后，NucView488阳性细胞大量减少，另外，洗前的图像中有很多圆形、胀大、模糊的被LysoTracker-Red和NucView488染色很弱的核，而在冲洗后这些核完全丢失了。从细胞形态及染色情况看，这些应属于晚期凋亡细胞。
接下来我们评估了荧光染色高内涵法的自动表型算法（图5）。5637细胞分别经过DMSO、200nM紫杉醇处理24小时、200nM紫杉醇处理48小时。不同表型的细胞被不同颜色轮廓标记出来：分裂间期细胞为白色，有丝分裂细胞为红色，早期凋亡细胞为绿色，晚期凋亡细胞为黄色。为了评估自动分析的准确性，我们从每种处理中随意挑选了12张图片进行手动计数，作为标准与自动分析结果进行比较。结果显示两种计算方法非常相近，虽然自动分析中间期细胞数量略高，有丝分裂和凋亡细胞数量略低，但是误差很小，并不影响药物评价。
图4 人类膀胱癌5637细胞基于抗体和基于染料的实验对比。（A）基于抗体和基于染料的实验中单一通道和叠加图像的对比，DMSO对照（左）和200nM紫杉醇（右）处理24小时。（B）柱状图显示了两种实验方法在DMSO和200nM紫杉醇处理24小时处理后的对比，对比参数包括总细胞数、有丝分裂细胞数和凋亡细胞数。所有的细胞计数都是每孔统计了超过4个视野，并取超过48个重复孔的平均值得到的。（C）细胞被200nM紫杉醇处理48小时后用染料染色，对比实验孔板在冲洗前后同一位置单一通道和叠加图像。
图5 染色实验方法的图像自定义分析分割结果。5637细胞在DMSO、200nM紫杉醇处理24小时和200nM紫杉醇处理48小时后的原始图像（上）和Hoechst分析图像（下）。分裂间期细胞为白色，有丝分裂细胞为红色，早期凋亡细胞为绿色，晚期凋亡细胞为黄色。（B）自动分析（蓝色）和手工计数（红色）的比较，依次为总细胞数、有丝分裂细胞数、凋亡细胞数和晚期凋亡细胞数。所有的细胞数均为超过12个图像的平均值。
单细胞分析的未来
目前科学界认为，如果能深入了解单细胞的行为以及它们和微环境的相互作用，就能衍生出很多具有冲击性的发现。从近来的综述性文章我们可以发现，研究单细胞分析技术尤其是从传统细胞研究方法向高通量单细胞分析方法转变是必要的。
LINCS项目不仅拥有全新的高通量平台测序技术及平台，包括ImageXpress® Micro高内涵成像分析系统等，使之可以准确找到如单细胞代谢率的生物学标签的实时信号改变；更重要是在于对进行大规模数据库的建立和大数据的分析，使我们在后基因组时代进一步加快了转录组学、蛋白组学及单细胞代谢组学等的发展。LINCS技术得到的海量数据信息和分析比对结果将极大影响人类对生命科学的研究及对人类疾病的了解，从而进一步改善人类的环境、医疗及健康状况。与此同时，也为制药/诊断公司提供了一个商业契机，可以利用LINCS技术平台为研究者或临床医生提供更为准确可靠的生物学数据或个性化的诊断数据。
