选择重组蛋白表达的合适方法（三）
五、哺 乳 动 物 细 胞
以前通常认为哺乳动物表达方法是重组蛋白表达效率最低的方法。然 而 ，最近的研究进展已经极大地提高了哺乳动物细胞系的表达水平(详 见 第 15章)。例如, 有报道称利用稳定转染的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,C H O )细胞，重组抗体的表达水平可以达到几个毫克每升(Figueroa e t a l . ， 2007; W urm, 2004)。 虽然目前已经测试了多种细胞系和表达策略，但本章我们主要关注人胚肾（human embryonic kidney,H E K 293)细胞的瞬时转染和C H O 细胞的稳定转染。
H E K 293 细胞系来源于腺病毒转化的人胚胎肾细胞。利用特定的转染试剂，如阳离子 脂 质 体（cationic lipids) 、憐 酸 耗（calcium ph o sp h ate)或 聚 乙 烯 亚 胺（polyethyleneim in e)，H E K 2 93细胞能够实现较高的瞬时转染效率（> 8 0 % )(D u ro ch er et aL , 2002;Jo rd an etaL , 1996)。 对于大规模的瞬时转染( > i 〇 0 mL)，相比阳离子脂质体，以磷酸钙或聚乙嫌亚胺作为转染试剂是更加经济高效的选择 (Baldi et a L ， 2007)。 已经有人进行了生物反应器级别的瞬时转染，不过对于大多数实验室来说, 这个规模在技术上还是很有挑战性的 (G irard etal. , 2002)。瞬时转染技术相对简单，而且对于给定的重组蛋白，其评估 可 在 2 周内完成。
当需要大量的重组蛋白时，通常选择 C H O 细胞作为哺乳动物表达系统。例如 ，当前市场上大部分治疗用抗体就是用该细胞系生产的。标准的稳定转染 C H O 细胞表达技术涉及使用具有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,D H FR) 选择标记表达框和目标基因表达框的载体转染 D H F R 缺陷型的 CH◦ 细 胞（W urm ，2004)。二氢叶酸还原酶能将二氢叶酸（dihydrofolate) 还原为四氢叶酸（tetrahydrofolate)，后者对于嘌呤（purine)、特定的氨基酸和脱氧胸苷酸 (thymidylic acid)的从头合成是必需的。氨甲蝶呤 (methotrexate)能结合并抑制 D H FR，可作为选择试剂使用 ，只有整合了 DHFR 选择标记表达框的细胞才能存活。连续提高氨甲蝶呤的浓度能造成 D H F R 基因及与其相连的目的基因的大量扩增。经过至少一轮的氨甲蝶呤筛选后, 利用有限稀释法将稳定转染的细胞克隆到多孔板中，就实现了稳定转染细胞群的亚克隆。通常的情况是，筛选得到的亚克隆中只有小部分能够以较高的水平表达重组基因，因为大部分克隆中表达框都整合到了转录不活跃的异染色质区域。不幸的是，整个选择和筛选的过程需要至少 2〜3 个 月 ，这 是 CHO表达方法最主要的缺点。不过 ，目前基于流式技术和自动化技术的高通量技术已经大大简化了高表达克隆的快速筛选和选择 (Browne and Al-Rubeai，2007)。另外一个进展是利用位于重组基因表达框两侧的特异性顺式作用 D N A 元件 (e x a c tin g DNA element),它们可以使整合位点的转录变得活跃 (Kwaks and O tte，2006)。不幸的是，大部分此类D N A 元件由公司拥有，实验室使用时必须得到公司的许可。此外，即使有了上述的进展，获得高表达 C H O 克隆株需要的时间依然没有太大的变化。
哺乳动物表达系统主要用于制备分泌的重组蛋白，而不是制备胞内表达的蛋白质。已经开发出了针对 C H O 和 HEK293细胞系的无血清培养基, 这使分泌表达的重组蛋白的纯化变得简单。不过, 这种培养基价格不菲，使得大规模的生产非常昂贵。
相较于其他表达系统的宿主，哺乳动物细胞具有最出色的蛋白质折叠和二硫键形成能力。哺乳动物细胞生成的N-连接聚糖和 0-连接聚糖的结构变化很大，这不仅取决于蛋白质，也与作为表达宿主的哺乳动物细胞的类型相关（Jenkins et al., 1996)。此外，细胞的培养条件，如营养成分、p H 、温度、氧气的水平以及氨浓度都能够对糖基化产生显著的影响 (Butler，2006)。 JV-连接糖基化的糖会是寡聚甘露糖(〇 lig 〇 mannose)、杂合聚糖及别的复杂聚糖结构，但所有的结构都会包含— 个 Man3 GlcNac2 核 心（Bhatia and Mukhopadhyay，1998)。寡甘露糖聚糖有 2〜6 个附加的甘露糖残基，这些残基可被磷酸化或硫酸化。最常见的复杂聚糖结构具有 2〜4 个连接于 甘 露 糖 的 Gal ，4-GlcNac2 基团 ，它能够形成 2 个 、3 个 和 4 个触须样的分支结构。分支结构末端为唾液酸，分支上还可连接岩藻糖。杂合聚糖同时具有寡聚甘露糖和复杂聚糖结构的特征^ 可根据其核心结构将O 连接糖基化结构分为 8 类 : 0 乙醜半乳糖胺型糖基化(〇 GalN Ac-type glycosylation)、O-乙酰氨基葡糖型糖基化（O G lcN A otype glycosylation)、O-岩 藻 糖 基 化（Ofucosylation)、O-甘•糖基化（Om annosyiation)、O-葡糖基化（O glucosylation)、憐 酸 糖 基 化(phosphoglycosylation)、O-葡 糖 胺 聚 糖 型 糖 基 化（〇 ——glyc 〇 saminoglycan-type glycosyiation)和胶原型糖基化（collagen-type glycosylation) (Peter-Katalinic，2005)。
六、蛋白质的特性
在选择表达系统时, 可以很容易地通过文献调研来确认重组蛋白之前是否已被表达过并对公开出版的表达策略做出评估。借鉴文献报道时，考虑清楚文献中重组蛋白的应用目的与你的预期应用是否相似或相容是很重要的。缺少文献信息时，表达或详细介绍同源蛋白的报道也是很有用的。在过去的十年，表达的蛋白质的数目有了戏剧性地增加，这在一定程度上归功于多种基因组序列的测定、高通量表达方法的发展以及大规模的蛋白质结构计划（protein structure initiative,P S I )。这种趋势很可能会持续下去，这意味着最终前人的大量数据可以使表达系统的选择变得更加简单容易。
1. 蛋白质的特性： 大肠杆菌与密码子用法
—般来说，在重组蛋白表达宿主的选择中，对原核来源的蛋白质应当只选择大肠杆菌进行表达，而不是真核表达系统, 因为通常真核生物的翻译后修饰能力和改善的折叠能力对原核蛋白来说是不必要的，甚至是不想要的。对于真核蛋白来说情况就不同了，因为有大量的实例表明，真核蛋白能在大肠杆菌中进行成功地表达（Sahdev et al. ， 2008)。当使用原核系统表达真核蛋白时 ，一 个非常重要的考虑是: 像所有生物一样，大肠杆菌对密码子的使用有偏性，其 t R N A 丰度反映了这一•偏性（Gustafsson et al. ， 2004; M a r i n ，2008)。表达含有数个大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白时会受对应的 t R N A 丰度的限制而效率不高。 tR N A 短缺会导致翻译移框、氨基酸错误掺入及翻译提前终止等。这个问题在稀有密码子集中分布于 N 端时尤其明显（K a n e , 1995)。不过, 通过合成密码子优化的 基 因 或 者 使 用 稀 有 密 码 子 t R N A 丰 度 增 加 的 商 业 化 工 程 菌 株（如 R osetta 菌 株 ，E M D ——N o v a g e n ) 可以避免这个问题。在多数情况下, 如果重组基因是在亲缘关系很远的生物宿主中表达, 密码子偏性也需要加以矫正。
2. 蛋白质的特性: 胞质蛋白
对于胞质蛋白来说，选择最佳的表达系统取决于蛋白质的大小和分子内二硫键的数目。对于分子质量为10〜50 kD a 并含有极少二硫键的蛋白质而言，大肠杆菌是实现蛋白质可溶性表达的很好选择（D y s o n e ta L ， 2004)。 对于更大或具有许多二硫键的蛋白质来说 ，如果需要 可 溶 性 表 达 ，那 么 通 常 应 优 先 选 择 杆 状 病 毒 或 酵 母 表 达 系 统 。对于10 k D a 以下，有极少甚至没有二硫键的蛋白质，已通过融合可溶性标签，在大肠杆菌中实现了成功表达（Esposito and Chatterjee, 2006)。 或者, 也可以将这些小蛋白质在毕赤酵母中进行分泌表达(Daly and H earn, 2005)。 然 而 ，在这一途径中, 必须小心监测 ，因为正常情况下存在于胞内的蛋白质被强制进入分泌途径时可能出现无意产生的糖基化。这可以通过检查序列确认其不含一致的N-连接糖基化位点来实现。遗憾的是，对 于 〇-连接糖基化，没有保守序列，所 以必须对分泌的重组蛋白进行分析以确保其不含〇-连接聚糖。
3. 蛋白质的特性： 分泌蛋白
所有的表达宿主都可用于生产分泌蛋白。不过，正如之前所述，大肠杆菌缺少大部分发现于真核生物中的翻译后修饰功能。因此，大肠杆菌可能不适于表达分泌的真核蛋白，不过这也在很大程度上取决于下游的应用。
4. 蛋白质的特性: 膜蛋白
对于蛋白质的大量表达来说，膜蛋白极具挑战性。在某些情况下，只表达可溶的、亲水的部分就足够了，此时可以移除跨膜结构域，表达可溶部分。对于完整膜蛋白的表达，如何选择最佳的表达系统还没有明确的指导原则 (Sarramegna et al. ，2003)。不过 ，对于大部分真核膜蛋白，由于在折叠和翻译后修饰能力上的限制，大肠杆菌表达系统通常不是一个很好的选择。相对的，研究者已报道利用杆状病毒和酵母表达系统在一定程度上成功地实现了 G 蛋白偶联受体的表达。
5. 蛋白质的特性: 毒性蛋白
对表达宿主有毒的重组蛋白会给表达带来挑战, 不过这通常是可以克服的。如果重组蛋白有毒性，确定其毒性是否具有宿主细胞特异性通常是有用的。如果是的话，那么可以选择在一个相容性更好的表达宿主中进行表达。另一个选择是使用严格调控的、可诱导的表达系统，如在大肠杆菌和毕赤酵母中应用的那些表达系统。例如 ，已经开发了数个精确调控的可诱导大肠杆菌表达系统(Saida, 2007)。在这些系统中，重组基因的表达由可诱导启动子、转录终止子、质粒拷贝数的控制或重组基因编码序列的修饰来调控。在可用的毕赤酵母系统中，A O X l 启动子受诱导机制以及阻遏/去阻遏方法的联合严格调控(Daly and H eam , 2005)。 另外，有数项研究表明杆状病毒/昆虫表达系统可用于表达毒性蛋白（Aguiar et al., 2:006; Korth and Levings，1993)。 最后 ，对于哺乳动物表达系统来说 ，最简单的选择是瞬转表达。 C H O 细胞中的数种可诱导表达系统都需要花费相当多的时间以完成必要的细胞工程改造，而且利用这些表达系统很难获得严格调控的基因表达 ，而这种严格调控对于防止细胞死亡来说是必需的 (Rossi and Blau, 1998)。
七.重组蛋白的应用
用于结构研究时，重组蛋白的表达要求正确的蛋白质折叠、形成正确的二硫键、均一的重组产物。前面已经介绍了每种表达系统的蛋白质折叠和二硫键形成的内在能力。不均一性的潜在来源包括鱗酸化、甲硫氣酸氣肤酶(methionineaminopeptidase) 对起始甲硫氨酸的低效切割以及糖基化。不幸的是, 不均一的磷酸化常见于重组蛋白激酶的表达,并且每一种表达宿主都有类似报道。在这种情况下, 可以通过磷酸酶处理去除重组蛋白上的磷酸基团以获得均一性。当重组蛋白在胞内表达时，可能会出现 N 端甲硫氨酸的不均一性。原核生物和真核生物都含有甲硫氨酸氨肽酶，甲硫氨酸的切割效率受起始甲硫氨酸相邻的氨基酸的影响 (Giglione etal., 2004)。 通 常 ，该相邻氨基酸侧链的大小与甲硫氨酸切割的效率负相关。然而，在大肠杆菌中，高水平表达的重组蛋白会使酶达到饱和 ，并改变有效切割的相关规则 (Dong etal.，1996)。 这种不均一性可以通过小心选择起始甲硫氨酸的相邻氨基酸或利用 N 端的可切割的标签来避免。糖基化的不均一性可见于糖蛋白在所有真核生物中的表达。不过在昆虫或酵母宿主中这种不均一性通常会低一些 (Jenkins etal. ，1996)。 无论采用何种表达宿主, 通常会在试图对重组蛋白进行结晶前除去糖基团。
正常情况下，若制备的重组蛋白用做免疫用抗原时，任何表达宿主都是可用的。对于糖蛋白来说，有 时 还 不 清 楚 聚 糖 的 存 在 是 否 会 改 变 重 组 抗 原 的 免 疫 原 性（Bhatia andMukhopadhyay, 1998； Prasad et al., 1995)
适用于体外活性研究及体内实验的重组蛋白的制备要求蛋白质正确折叠和二硫键正确形成。对于糖蛋白来说，N -连接聚糖的存在以及聚糖基团的结构对这两类应用都有重要的影响，因此在选择真核表达宿主时必须加以考虑。研究 表 明 ，JV-连接聚糖对蛋白质的结构有积极的影响并增加了蛋白质的稳定性 (Bhatia and M u k h o p a d h y a y , 1998)。在体外 ，已有研究显示, 某些蛋白质配基上的N -连接聚糖的结构会影响其与受体结合的亲和力及信号转导。在重组免疫球蛋白中，F c 区 保 守 的 N -连接聚糖影响了其在体外的效应活性(Presta, 2008)。例如，人 I g G l 的 N -连接聚糖中岩藻糖的存在降低了抗体依赖的细胞毒性活性(Shinkawa etal.， 2003)。在体内，蛋 白 质 上 N -连接聚糖结构极大地影响了其代谢清除和生物分布。例如 ，无唾液酸帽的 N -连接聚糖会被肝受体 (hepatic receptor),清除这类受体包括脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein) 受体和甘露糖受体 （Weigeland Yik， 2002)。 O-连接糖基化的重要性还不明确。如果重组蛋白的糖基化修饰作用还不清楚，那么比较安全的策略是选择与重组基因来源宿主相似的表达宿主。
八.结论
大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒/昆虫细胞及哺乳动物表达系统在表达重组蛋白方面各有其优缺点 (表 11.1)。一个给定的表达系统能否高水平表达蛋白质并获得高质量的产品, 这在很大程度上取决于该蛋白质。在选择表达方法时，必须认真地评估重组蛋白的特性及下游的应用。不幸的是，有时候表达方法的选择并不是显而易见的，此时必须对数种表达宿主进行评估。
