DNA序列测定技术（Sanger双脱氧链终止法与Maxam－Gilbert ...
选择随机定向测定策略的影响因素
（1）计算设备
任何大规模的测序计划将在很大程度上依赖计算机程序对原始序列资料进行分类、整理和排列（Staden，1986）。在权衡随机法的利与弊之时，必须将与适当的计算机设备进行联机的问题放到压倒一切的位置上来考虑。如果这些设备尚无从适当的计算机设备进行联机的问题放到压倒一切的位置上来考虑。如果这些设备尚无从谈起，就必须将采用随机策略的想法束之高阁，转而从前已述及的两种定向方法中择一而行。
（2）靶DNA 的性质：如果靶DNA 很可能会有散在的重复序列，那么就应当组建嵌套的缺失体用于测序。计算机在区分重复序列方面可能束手无策，而寡核苷酸引物则会同多个位点发生退火。
（3）完成测序计划所需时间：完成一个测序计旬所需工作蜈可通过以下指示进行估计：
1）从单套反应中平均可是300-400核苷酸的序列。
2）一个人一天可以轻松自如地操作24-32套反应。
3）因此一个测序工作周，可以测出15kb核苷酸序列，这一周包括：
a.用一天时间制备单链DNA 模板。
b.用一天时间测定DNA 序列。
c.用一天读出原始DNA 序列并加以排列。
d.再用两天生物旱生测序、重新进行电泳，以便澄清模棱两可这处并取得各个克隆之间的重叠区序列。
采用随机法，所要测定的序列通常会比靶DNA
所具有的实际长度4－6倍。在大多数情况下，直至双链90%左右的序列测出以后，才能得到单一的一段邻接不断的序列。由于进行测序的亚克隆是随机挑选出来的，因此靶DNA
某些区段的序列在全段序列未能测出前会被重复测定，至于需要多长时间才能找出最后几个亚克隆并进行测序，从而使序列提以测全，则无法未卜先知。往往会发现，以上亚克隆在文库中得不到充分反映，因此南非要处用与侧翼序列相应的寡核苷酸探针进行筛选，以分离这些亚克隆。利用限制酶将大分子靶DNA
进一步分为大小适中（4－5kb）而易于处理的片段，可以使上述推理上难题得以缓和，每一个这样的片段都可以用随机法单独进行测序。
定向缺失法有时需要投入大量的时间生成并鉴定一整套嵌套的缺失体。然而一旦这上步水到渠成，则可以从靶DNA
上早以妥善安排的多个区段上互为相反的两端向内部延伸，才能测定DNA 双逻的全序列。另一种办法是用单套缺失突变体来取得靶DNA
单链的序，然后利用其信息合成一套寡核苷酸引物，以便用于确证DNA 互补链的序列（见后）。
（4）使用寡核苷酸合成仪的方便程度：如果能够无拘无束地使用寡核苷酸合成仪，则可快速、廉价地合成由用户设计的引物。假定要花1－2天时间来合成一个寡核苷酸，那么在最快速度下每周可以由靶DNA
的一个特定起点开始从头测定600-800个核苷酸的序列。如果同时使用几个起点开始从头测序；
或者也可以将M13mp18和M13mp19噬菌体载体，利用通用引物同时从两端开始测序；或者也可以将序列内部的限制酶切片段亚克隆循下列原则：设计
DNA 测序物时，应遵循下列原则：
1）应寡核苷酸与靶DNA 的正确主靶DNA 中确凿疑的序列相互补。尤其是利用循序渐进的寡核苷酸法来测定从未测过的DNA
序列时，这一点更加重要。尽量让新设计的寡核苷酸互补于已知序列的最远端，这是十分自然的人民代表倾向。然而在大多数情况下，该序列是从测序凝胶顶部间隔紧密的条带中读取的，而在此处发生阅读错误往往司空见惯。因此紧好保守一些，让所设计的引物与位于样品泳前沿之后一定距离内的序列机互补，在凝胶的这一区段上读出的序列可信程度较高。
2）引物的碱基组分比便应匀称[40-55%（G＋C）]， 而且长度至少应有18个核苷酸。 如果（G＋C）%
在上述阈值之外，应将寡核苷酸长度设计为（18+n/2）个核苷酸，其中对AT丰富区，则n=50-（G＋C）%对GC丰富区，则n= （G＋C）%－50。
3）检查新设计二重对称区，因为可自杂交形在发夹或茎环结构的寡核苷酸是低物。效引
a.其中不含二重对称区，因为可自杂交形成发夹或茎环结构地寡核苷酸是低效引物。
b.它既不会同载体DNA 也不会同序列已经测出的靶DNA 区段相互补，如能保证这一点，将大大减少寡核苷酸从模板DNA 的不只一个位置上引导DNA 合成的可能性。已商品化的大部分用于DNA 分析的计算机程序都能够从序列中检索合成寡核苷酸的互补区。
（5）序列的准确性：如果认真地进行DNA 序列测定，错误率将小于0.1 %。但要达到这样高的准确性，必须完整地测定靶DNA
两条链的序列并澄清棱两可及相互矛盾之处。在这一点上随机测序有其优点，因为在该方法中耐需要骤步对丰余的原始序列资料进行累积，从而使最终所排出的序列的准确性大为改观。然而靶DNA
中可能存在一些区域，无论采用随机法还是定向法都不能准确测定其序列。解决这些凝难序列往往需要花费意外长的时间，有时还要使用碱基类似物（以消除条带压缩现象）或Maxam-Gilbert测序法。
（6）测序计划的下一步打算：不同的测序策略将会得到不同类型的样品材料，这些材料可用于以后的实验。例如，为NDA测序而构建的多套缺失体可用于研究启动子区中的结构域，而与靶片段不同区段互补的多套寡核苷酸，可用于测定靶DNA
突变体的序列。为鸟枪法测序而构建可以留作随后进行定点诱变或制备放射性标记探针的材料。
