DNA重组（DNA recombination）技术：DNA序列测定-1
㈣ DNA聚合酶
如前所述，选用合适的DNA聚合酶进行测序反应也是保证测序质量的重要因素之一。常用于双脱氧末端终止法测序的有几种不同的酶：
1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）
此酶是最早用于建立Sanger测序的酶。但通常会有两个问题：①Klenow片段的持续合成能力较低，通常只能得到约250~350个核苷酸的序列，而且由于聚合酶随机从模板上解离而终止链延伸，通常会产生较高的本底和假带；②对同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域复制效能低下。但此酶价格便宜，对已知序列的亚克隆进行鉴定仍有应用价值。
2．测序酶（sequenase）
该酶是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，其原来很强的3′→5′外切酶活性，经化学修饰后大部分被消除。目前常用的测序酶大都是基因工程产品，完全缺失3′→5′外切酶活性，具有活性非常稳定可靠、持续合成能力强和聚合速度高等优点，是测定较长DNA的首选酶。市售的各种以该酶为基础的测序试剂盒，效果甚佳。
3．耐热DNA聚合酶
PCR技术的应用正在不断扩大，耐热DNA聚合酶应用于以Sanger双脱氧链终止法为基础的DNA测序方案，已发展成为被称为“循环测序”或“线性扩增测序”方法。在该类测序方法中，由于使用了耐热DNA聚合酶，与其他DNA聚合酶相比较具有二大优点。其一，由于采用热循环方法线性扩增模板DNA，获得清晰可辨的序列梯带所需要的模板DNA量少；其二，由于，耐热DNA聚合酶可在95℃高温下保持稳定，测序反应可以在高温（70~80℃）下进行。因而能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。因此，循环法可以方便地对PCR产物、质粒DNA、λDNA和粘粒DNA等双链模板进行序列测定，特别有利于对高GC碱基含量的模板测序。
循环测序法利用了热循环仪的自动循环的高效能力。循环测序反应与普通PCR反应有所不同。只需一条引物，通过单引物进行热循环，模板DNA以线性方式被扩增，而不是标准PCR的指数方式扩增；反应底物除四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入了双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），进行扩增时，链的延伸终止于掺入ddNTP的位置，产生分别终止于不同核苷酸的一系列不同长度的扩增片段。
㈤ 放射性标记
传统的DNA测序方法都采用α-32P-dNTP作为放射性标记物，但由于32P发射的高能β射线，常会引起二个问题。首先是导致放射自显影图谱条带扩散、分辨率低，限制了识读序列的数量和准确性。其次是32P衰变会导致DNA样品分解，通常都应在测序反应后24h内进行电泳，否则无法获得好的结果。
近年来α-35S-dNTP被广泛采用，是由于35S产生较弱的β射线，克服了32P的二大缺点。放射自显影图谱具有较高的分辨率和较低的本底，测序反应产物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降。
㈥ 关于DNA序列的识读
DNA序列的识读是一个熟能生巧的过程。注意几点技巧：①在显影前后一定要注意标明模板名称、日期和测序人等，并标明各套反应位置；②识读时从显而易见的特征序列开始，如连续的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出现的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到这种序列，便可较快地确定目的序列的位置。
二、Maxam-Gilbert化学降解法测序
几乎在双脱氧法发展的同时，1977年Maxam-Gilbert等提出了化学降解法。自Maxam-Gilbert初次提出以来，其实验方案基本上没有变化。
㈠ 原理
化学降解法与包括合成反应的链终止法不同，需要对原DNA进行化学降解。其基本原理是，首先对待测DNA末端进行放射性标记，再通过5组（也可以是4组）相互独立的化学反应分别得到部分降解产物，其中每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割。因此，产生5
组（或4组）不同长度的放射性标记的DNA片段，每组中的每个片段都有放射性标记的共同起点，但长度取决于该组反应针对的碱基在原样品DNA分子上的位置。此后各组反应物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通过放射自显影检测末端标记的分子，并直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。测序原理如图7-19所示。
图7-19化学裂解法测序原理
㈡ 待测DNA的末端标记
化学降解法测序首先要制备单侧末端标记的待测DNA片段。DNA片段的核素标记有三种方法：
1．利用T4噬菌体多核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记DNA的5ˊ-末端
对于去5′-磷酸化的DNA片段，T4噬菌体多核苷酸激酶可以通过正向反应将γ-32P-ATP的γ-磷酸基转移至DNA的5ˊ-末端；对于5′-磷酸化的DNA片段，在过量ATP条件下，该酶可以通过交换反应将γ-32P-ATP的γ-磷酸基与DNA的5ˊ-末端磷酸基发生交换反应而标记。但对于双链DNA片段，由于DNA的两侧均被标记，不能直接用于测序反应。需要经限制性内切酶切割，电泳分离二种不同大小的标记片段，或者直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离二条单链，但这种分离方法比较困难，较少使用。
