酵母菌基因组转座子诱变实验—mTn诱变基因产物表位标记
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | pGAL-cre含有2% (W V)棉籽糖的-Leu-Ura Raff CM缺失成分培养基平板和培养基含有2% {m V)半乳糖的-Leu Gal CM缺失成分培养基含有2% (m V)葡萄糖的-Leu Glc CM缺失成分培养基5-FOA培养基平板（5-FOA)丙三醇 无菌 30× |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1)用pGAL-cre(pB277)标准操作转化mTn诱变酵母菌株。在CM- Leu, -Ura缺失成分培养基平板上选择转化株。 此质粒包含以下元件：amp、ori、CEN和LEU2。 2)将转化株接种到2 mL的含有2% (m/V)棉籽糖的-Leu，-Ura的Raff/CM缺失成 分培养基里，棉籽糖作为碳源抑制GAL启动子。30℃通风孵育直到培养物生长到饱和状态。 3)在2 mL含有2%的半乳糖的Gal/CM-Leu缺失培养基中100倍稀释培养物，以半乳糖作为碳源。在2 mL含有2%的葡萄糖的Glc/CM-Leu失控培养基中100倍稀释一份同样的培养物，以葡萄糖为碳源，作为对照。30℃通气培养2天。 一些菌株在半乳糖中生长得很不好，但是半乳糖诱导有时很有效，尽管没有可见的生长迹象。 4)用以下方法检验菌株URA3标志物的丢失。 a.如果在2%的半乳糖的培养液中可见生长，用无菌水100倍稀释培养液，取10μL稀释液。 b.如果在2%的半乳糖的培养液中没有发现生长，从未经稀释的培养液中取10μL。 c.用无菌水100倍稀释2%的葡萄糖培养液，取10μL稀释液。 将取出的培养液滴在5-FOA培养基平板上；通过划散小滴隔离单克隆。30℃孵 育5-FOA培养基平板直到在接种了在半乳糖中生长的菌株的培养基平板上看到 菌株生长。 根据作者的经验，90%以上的被分析的细胞因半乳糖诱导造成由Cre重组酶介导的mTn编码的URA3标记切除。转座子编码的URA3基因丢失表现为克隆（在半乳糖培养基培养的菌株） 在5-FOA培养基平板上生长。因为葡萄糖抑制Cre重组酶表达，所以在葡萄糖培养基培养的 菌株在5-FOA培养基平板上应该不生长或很少生长。另一种方法也可印证：将第4步得到的 稀释培养液放入CM培养基中并影印在CM-Um缺失成分培养基上，30℃孵育两天。在半乳糖生长的培养液产生的Ura-细胞应比在葡萄糖中的多100倍。 5)从丢失了URA3 (半乳糖诱导后的独特标志)的菌株中收集单克隆，于-70℃存放在15% (m/V)的丙三醇中。 |
