耐高温酵母菌株的诱变选育
实验概要
通过实验，观察紫外线对酵母菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
实验原理
紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作为相对剂量）两种。微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射距离和时间。
如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的时间成正比，故照射时间的长短可作为相对剂量。一般用15W的紫外灯，距离固定在<30厘米>左右，选用致死率达90~99.9%所需的辐射时间进行诱变处理。但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需辐照3~5分钟，芽孢要10分钟，芽孢杆菌的营养体要1~3分钟，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用30秒，放线菌的分生孢子用30秒~2分钟。
辅射不宜在肉汤等成分复杂的液体中进行，以免化学反应的干扰；同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。照射前紫外灯宜先开灯预热20~30分钟，使光波稳定。
主要设备
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机
实验材料
菌种：酵母菌
实验步骤
1. 菌悬液的制备
1) 取培养24小时的酵母菌的斜面1支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的大试管中，振荡30分钟，以打碎菌块。
2) 将上述菌液离心（1500r/min，离心5分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
3) 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
2. 马铃薯琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
3. 紫外线处理
1) 将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
2) 取直径225px无菌平皿1套，分别加入上述菌悬液6－7ml，并放入无菌大头针于平皿中。
3) 将盛有菌悬液的1平皿置于磁力搅拌器上，在距离为750px，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射30s，60s，90s，120s，150s，180s。
4. 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
5. 涂平板取10-5、10-6、10-7三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6. 培养
将上述涂匀的平板，静置2min后，用黑布（或黑纸）包好，置36℃、42℃、50℃三个不同温度下培养24小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7. 计数将培养24小时后的平板取出进行计数，根据对照平板上菌落数，计算
1) 不同温度下菌的存活率
2) 不同紫外线处理时间菌的存活率
3) 同一温度下稀释倍数的准确性
稀释倍数 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 存活率% | 致死率% | |
温度（s） | 处理时间（数/皿） | |||||
36℃ | 0（对照） | |||||
30 | ||||||
60 | ||||||
90 | ||||||
120 | ||||||
150 | ||||||
180 | ||||||
42℃ | 0（对照） | |||||
30 | ||||||
60 | ||||||
90 | ||||||
120 | ||||||
150 | ||||||
180 | ||||||
50℃ | 0（对照） | |||||
30 | ||||||
60 | ||||||
90 | ||||||
120 | ||||||
150 | ||||||
180 |
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