单链 cDNA 的合成实验
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
去除 RNA 酶的双蒸水
10XRT-PCR 缓冲液（去除 RNA 酶的双蒸水，100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶缓冲液
MMLV 逆转录酶（100~200U/ul)
SUPERaseINRNA 酶抑制剂（20U/ul;Ambion)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四种 dNTP)
随机引物（5umol/L)
总 RNA(达到 2.5ug)
4. 实验器材
薄壁的 PCR 管
二、方法
1. 在冰上加 2ul50umol/L 的随机引物到薄壁的 PCR 管中（一个反应一管)。
2. 加入 2.5ug 的总 RNA。
3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。
4. 添加去除 RNA 酶的双蒸水（RNaSe-freeH20)，使体积达到 16ul。
5.70°C 加热 10min, 变性二级结构，然后立即放在冰上。
6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。
7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。
8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。
9.42°C 温浴 1h。
10.95°C 加热10min, 灭活逆转录酶。
11. 继续扩增步骤或停止反应，-2°C 储存。
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