兔抗人血清抗体的制备和效价测定
实验原理
凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性（Antigenicity）。当机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白（Immunoglobulin,
Ig）。含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。
医学上常见的抗原物质，种类很多，如病原微生物及其代谢产物（毒素），异种动物血清（各种抗毒素，免疫血清的来源），同种血型抗原，同种异体皮肤，器官等组织抗原，自身组织抗原，肿瘤细胞抗原。具有抗原性的各种化学成分有蛋白质、脂蛋白、多糖体、脂多糖、糖蛋白、多肽以及核蛋白等，这些抗原物质均可刺激机体产生抗体或细胞免疫反应。
机体在抗原物质的刺激下产生特异性免疫反应的过程，大体上可分为3个阶段。
1．致敏阶段（加工处理抗原阶段）：当颗粒性抗原初次进入人体内时，首先被巨噬细胞吞噬（可溶性抗原可直接被T淋巴细胞吞饮，多糖与鞭毛抗原物质可直接作用于B淋巴细胞）。通过巨噬细胞浆内溶酶体酶的作用，把抗原物质消化降解，而保留其抗原决定簇（特异性抗原成分）。经过加工处理的抗原分子结构比原来的小，抗原性却比原来的加强。当处理过的抗原与巨噬细胞的RNA结合成为抗原-RNA
复合物（抗原信息），就具有强烈吸引免疫活性细胞的作用，能把抗原-RNA复合物传递给免疫活性细胞（Immunologically
competent cell）,启动免疫反应。
2．反应阶段（淋巴细胞分化增殖阶段）：免疫活性细胞在受到抗原信息的刺激后，发生母细胞化，进而大量增殖。由于抗原的性质不同，刺激T细胞分化成致敏淋巴细胞。抗原信息刺激B细胞使分化成浆细胞。在分化过程中小部成为“记忆”细胞。由于“记忆”细胞的存在，即使抗原在浆内消失很久（数月至数年或更长）以后，仍能与再度进入体内的相应抗原迅速引起较强的免疫反应（回忆反应）。
3．效应阶段（发生免疫反应阶段）：当致敏淋巴细胞再次遇到相应抗原的刺激后，能释放出多种具有生物活性的物质（淋巴因子），参与细胞免疫反应；浆细胞可形成各种类型的免疫球蛋白（抗体），参与体液免疫反应。
在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。
抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。本实验采用双向免疫扩散法测定效价。
试剂和器材
一、试剂
福氏（Freund）不完全佐剂：将液体石醋30毫升，羊毛脂10克混合后融化，分装小瓶,经高压灭菌后，保存于4℃备用。
福氏完全佐剂：在福氏不完全佐剂中于配制乳剂时加入卡介苗即为福氏完全佐剂，浓度为10 mg／m1。
1.5％的琼脂糖：称取1.5g琼脂糖以巴比妥缓冲液(离子强度 0.05，pH8．6)配制,定容至100mL。
巴比妥缓冲液(离子强度0.05，pH8．6)：称取巴比妥钠10.3g, 加入1mol/L HCI8ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，用于配琼脂糖凝胶用。
二、材料
健康家兔2－3只，年龄6个月以上，体重2－3kg。
三、器材
注射器，研钵，解剖用具，玻璃板，打孔器，大表面皿。
操作方法
一、抗血清制备
选择健康家兔2－3只，年龄6个月以上，体重2－3kg，编号、标记。
二、胎甲球蛋白抗原乳剂的制备
取粗胎甲球蛋白制品（1－5mg/mL）1mL加等体积完全佐剂，按照配制佐剂的研磨法，在无菌条件下，制成乳白色粘稠的油包水乳剂。将值得的乳剂滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
三、免疫方法
在选择的家兔的四足掌处，剪去兔毛，经碘酒消毒，酒精脱碘后，皮内各注射
0.5mL抗原－福氏完全佐剂乳剂，以后每隔7－10天于两肩后侧及两髋附近皮下多点注射抗原－福氏不完全佐剂，共2－3次，初步测出效价后，再进行一次加强免疫，即从耳静脉注射抗原0.1－0.2mL，一周后放血。
四、抗血清的采集与保存
取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml
。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。
颈动脉放血时，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4℃冰箱保存。
五、抗血清效价的测定
用移液管量取溶化琼脂糖放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔（图4.7a）。中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl
1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度（见图4.7b）。
梅花型
（a）(b)
图4.9 抗血清效价测定示意图
注意事项
玻璃板必须仔细洗干净，制胶板时放置水平，是制得的琼脂板厚度均匀。
