动态浊度法定量检测乳糖一水合物中细菌内毒素...（二）
2 方法与结果
2.1 细菌内毒素标准曲线的建立和可靠性分析
用葡聚糖抑制缓冲液复溶 LAL，用无热原水稀释 CSE，使 其 最 终 浓 度 分 别 为 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 EU·mL-1。各取0.1 mL，分 别 加到预先加有 0.1 mL 鲎试剂的反应试管内，混合均匀，将反应试管插入设置好的 PKF 细菌内毒素定量检测系统中，每一浓度重复 3 管，同时做 2 管阴性对照。当阴性对照的吸收度或透光率小于标准曲线最低点的检测值，反应时间大于标准曲线最低点的反应时间时，将全部数据进行线性回归分析。Pyros® EQS 软件自动出具标准曲线回归报告，以到达反应终点所需时间的对数值对细菌内毒素浓度的对数值绘制标准曲线：logT=-0.200logC+2.943 r=0.985 4
标准曲线中 CSE 的最低浓度为 0.001 EU·mL-1，此浓度点的反应时间小于阴性对照的反应时间［1］，故标准曲线成立。细菌内毒素标准曲线及可靠性分析结果见表 1。
1细菌内毒素标准曲线及可靠性分析
Tab. 1 Standard curves of bacterial endotoxinand reliability analysis
| 标准曲线中细菌内毒素浓度（standard curves concentration）/（EU·mL-1） |
CV/% | |
| 配置值（preparation value） | 实测值（measured value） | |
| 0.032 | 0.02740 | 2.537 |
| 0.016 | 0.01603 | 2.666 |
| 0.008 | 0.008968 | 1.259 |
| 0.004 | 0.005138 | 7.383 |
| 0.002 | 0.002325 | 15.951 |
| 0.001 | 0.00073 | 27.251 |
2.2 最大有效稀释倍数（MVD）的确定
取乳糖一水合物样品粉末 0.5 g，用 5 mL 无热原水溶解并稀释，制得终浓度（C）为 100 mg·mL-1 的
溶液。，按细菌内毒素限值（L）0.005 EU·mg-1，标准曲线最低浓度（λ）0.001 EU·mL-1，计算乳糖一水合物样品的 MVD：MVD=100 mg·mL-1×0.005 EU·mg -1/0.000 1EU·mL-1=500 倍
2.3 干扰试验
根据标准曲线内毒素浓度的设置，选择标准曲线中点 0.004 EU·mL-1 作为加标内毒素浓度（λm）。取
批号 Lactose-1031D73、Lactose-1031D74、Lactose-1031D75、Lactose-1031D76 的乳糖一水合物粉末 0.5 g，分别溶于 5 mL 无热原水中，静置，待样品完全溶解后再分别稀释至 100、300、500 倍，作为供试品溶液，将0.1 mL 0.004 EU·mL-1（λm）浓度的 CSE 溶液分别加入到 0.9 mL 100、300、500 倍的供试品溶液中，制备供试品阳性对照溶液。分别取阴性对照、供试品溶液、供试品阳性对照溶液各 0.1 mL，加到预先加有 0.1mL LAL 的反应管内，混合均匀，将反应试管插入设置好的 PKF 细菌内毒素定量检测系统中进行测定，各反应均做 2 个平行复孔。测定结束后，Pyros® EQS 软件自动出具试验数据及报告，结果见表 2。
2干扰试验及供试品细菌内毒素含量测定结果
Tab. 2 Interference test and content determination of bacterial endotoxin in samples
| 批号 （lot No.） |
稀释倍数 （dilution factor） |
细菌内毒素浓度（concentration）/（EU·mL-1） | 回收率 （recovery）/% |
限值 （limit） |
||
| 加标值 （spiked） |
平均值 （mean） |
阳性对照 （positive control） |
||||
| Lactose-1031D73 | 1∶100 | 0.004 | <0.001 | 0.002 671 | 94.0 | 0.5 |
| 1∶300 | 0.004 | <0.001 | 0.003 344 | 104.0 | 0.5 | |
| 1∶500 | 0.004 | <0.001 | 0.002 787 | 102.0 | 0.5 | |
| Lactose-1031D74 | 1∶100 | 0.004 | <0.001 | 0.003 422 | 89.0 | 0.5 |
| 1∶300 | 0.004 | <0.001 | 0.002 727 | 93.0 | 0.5 | |
| 1∶500 | 0.004 | <0.001 | 0.003 052 | 91 | 0.5 | |
| Lactose-1031D75 | 1∶100 | 0.004 | <0.001 | 0.003 241 | 107.0 | 0.5 |
| 1∶300 | 0.004 | <0.001 | 0.004 064 | 99.0 | 0.5 | |
| 1∶500 | 0.004 | <0.001 | 0.004 683 | 101.0 | 0.5 | |
| Lactose-1031D76 | 1∶100 | 0.004 | <0.001 | 0.002 413 | 116.0 | 0.5 |
| 1∶300 | 0.004 | <0.001 | 0.004 273 | 105.0 | 0.5 | |
| 1∶500 | 0.004 | <0.001 | 0.003 484 | 110.0 | 0.5 |
根据标准曲线计算不同稀释倍数下供试品溶液中细菌内毒素的含量及回收率，Pyros® EQS 软件的数
据与报告系统中会自动出具报告和细菌内毒素检测结果。干扰试验中各批次的供试品，经 100、300、500倍稀释后，其回收率在 50%~200% 范围内，符合要求［1］，可以认为供试品溶液中成分不存在干扰作用。
2.4 供试品定量检查
供试品检查同“2.3”项下方法，实验结果参见表2，结果 4 批样品细菌内毒素含量均符合规定。
3 讨论
3.1 方法开发的意义
本试验用动态浊度法检测福沙匹坦二甲葡胺注射液的辅料——乳糖一水合物中的细菌内毒素含量。动态浊度法是常用的细菌内毒素定量检测方法，通过检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸收度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度来定量测定样品中内毒素的含量。该方法操作简单、快速、灵敏度高、检测范围宽。动态浊度法的干扰试验中，以样品中外加内毒素的回收率进行判断，若回收率在50%~200% 之间，可认为样品溶液对试验无干扰［5-9］。该方案相对于传统的凝胶法，具有灵敏度高、稳定性好、操作简便、节约时间等优点［6，12］，能够更好地满足药品质量控制的要求。该试验的另外一个重要意义，是选择对辅料进行检测。对辅料乳糖一水合物进行细菌内毒素定量检测是对福沙匹坦二甲葡胺注射液药品的源头进行精准的质量把控，是更高级别的质量控制要求［2］。
3.2 葡聚糖抑制缓冲液可以解决葡聚糖干扰问题
本试验使用葡聚糖抑制缓冲液来复溶 LAL，该缓冲液在内毒素试验中可以阻断（1 → 3）-β-D-葡聚糖的干扰。当供试品溶液中同时存在细菌内毒素与（1 → 3）-β-D- 葡 聚 糖 时，会产生假阳性反应，另外，和不存在（1 → 3）-β-D- 葡聚糖相比，凝胶反应会更迅速、更剧烈［13］。假阳性反应与
（1 → 3）-β-D- 葡聚糖的存在有关，原因是 LAL 中葡聚糖敏感因子（G 因子）被激活，使得供试品中细菌内毒素含量虽然并未超过规定限值，但检查呈现阳性，被误判为不合格［6，13］。如不确定某样品是否受到（1 → 3）-β-D- 葡聚糖干扰，在针对同一样品的测试中，将非葡聚糖抑制缓冲液复溶的 LAL 检测的细菌内毒素水平与葡聚糖抑制缓冲液复溶 LAL 检测的细菌内毒素水平进行比较，如果使用葡聚糖抑制缓冲液复溶的报告中细菌内毒素含量明显较低，则说明样品可能有（1 → 3）-β-D- 葡聚糖干扰。葡聚糖抑制缓冲液可有效阻止由高达 100 ng·mL-1 的葡聚糖浓度引起的干扰，使鲎试剂对于供试品的抗干扰能力大大增强。
3.3 高灵敏度鲎试剂可拓宽最大有效稀释倍数
用 凝 胶 法 测 试 该 样 品 时，采 用 灵 敏 度 为 0.03EU·mL-1 的凝胶法鲎试剂进行试验，乳糖一水合物样 品 的 最 大 有 效 稀 释 倍 数：MVD=CL/λ=100 mg·mL-1×0.005 EU·mg-1/0.03 EU·mL-1=16 倍，供试品对试验干扰明显，由于试剂灵敏度的限制，样品无法稀释更大的倍数来消除干扰。LAL 的最高灵敏度能达到 0.001 EU·mL-1，使得供试品的最大有效稀释倍数扩增至 500 倍，动态浊度法的干扰试验，以样品中外加内毒素的回收率进行判断，在稀释倍数 为 100、300 和 500 倍 时 均 有 极 佳 的 回 收率，回收率 在 50%~200% 之 间，可认为样品溶液对试验无干扰。LAL的高灵敏度，可以增大样品的 最大有效稀释倍数，降低样品对内毒素反应带来的干扰［5，13］。
3.4 符合法规与数据完整性要求
PKF 细菌内毒素定量检测系统与 Pyros® EQS 软件严格遵循联邦法典 21 CFR Part 11 标准，同时符合
《中国人民共和国药典》、USP、JP、EP 等多国法规的规定与要求，软件具备三级管理权限、审计追踪及电子签名功能，满足试验的数据完整性要求。本文采用动态浊度法对福沙匹坦二甲葡胺注射液中的辅料乳糖一水合物进行细菌内毒素定量检测，试验结果表明，样品进行 100 倍、300 倍、500 倍稀释时均对试验无干扰，多批样品检查结果符合规定。因此，在 PKF 细菌内毒素定量检测系统上开发动态浊度法来定量检测福沙匹坦二甲葡胺注射液的辅料乳糖一水合物中细菌内毒素含量的方法是可行的。
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