双歧杆菌血凝特性的研究（一）
血凝试验已被广泛应用于研究细菌与宿主细胞之间的粘附［1，2］。广义而言，血凝素也是一种粘附素，已证实一些细菌的血凝素和粘附素为同一物质，如肠毒性大肠杆菌的菌毛既能粘附于人或动物的肠上皮细胞，又能凝集不同种的红细胞，呈现甘露糖抵抗血凝(MRHA)。血凝试验已作为一些细菌的粘附能力的标志，并用作菌毛检测分型及鉴别毒力的依据［3，4］。双歧杆菌是人体肠道最重要的生理性细菌，它的粘附与定植对维持肠道正常菌群的稳定，抵御外来细菌的入侵起主导作用。但迄今为止，尚未见到双歧杆菌血凝特性的研究报道，本研究系统地观察了双歧杆菌的血凝特性。
1、材料与方法
1.1 血凝试验
1.1.1 菌株及生长条件 双歧杆菌1027及1124株为本所从健康婴儿粪便分离，经多次生化鉴定为青春型双歧杆菌。日本青春型双歧杆菌标准株由深圳南山区医院曾忠铭博士提供。将细菌分别接种于双歧杆菌选择性琼脂平板及硫乙醇酸盐液体培养基，37℃，厌氧培养48h后，固体生长的细菌用pH7.4PBS，液体生长的细菌分别用耗尽培养液上清、新鲜培养液及PBS悬浮细菌，调整菌悬液浓度为1×108/ml。
1.1.2 血凝试验 采取人O型、人B型、绵羊、兔、鸡和小鼠新鲜血(柠檬酸盐抗凝)，红细胞经0.9%盐水洗涤3次后，悬浮于盐水内，制成2%(V/V)红细胞悬液。将等量(150μl)对倍稀释的细菌悬液和红细胞悬液加入“U”形底的40孔酶联反应板内，振荡后，置37℃温育1h观察结果，并经显微镜下观察证实。能引起血凝反应的菌悬液最高稀释度为血凝滴度。
1.2 各种处理因素的影响
1.2.1 对耗尽培养液上清的处理 耗尽培养液上清分别经胰蛋白酶(37℃ 30min)，牛血清白蛋白(BSA)(37℃ 30min)，氢氧化钠(37℃ 30min)和高温(100℃10min )处理后，进行血凝试验。
1.2.2 对红细胞悬液的处理 红细胞悬液分别经不同浓度过磺酸钠(37℃ 30min)或胰蛋白酶(37℃ 30min)处理后，进行血凝试验。
1.2.3 各种糖抑制试验 于双歧杆菌耗尽培养液上清中分别加入葡萄糖,乳糖，蔗糖，D-果糖，L-山梨糖，棉子糖，麦芽糖，纤维二糖，D-木糖，鼠李糖及D-甘露糖(终浓度1%)，进行试验，用pH7.4PBS作对照。
1.3 双歧杆菌脂磷壁酸(LTA)的提取 将液体培养的双歧杆菌细菌悬液离心3000 rpm，10分钟，上清即为细菌耗尽培养液上清。参照文献［5～7］，于耗尽培养液上清中加入等体积重蒸酚,在 65℃ 下振摇30min，冷却后，离心4000rpm20min，收集 水相。重复酚提一次，终产物经蛋白酶K消化以去除残留蛋白。
