方案12 应用分子扫描器进行蛋白质组分析实验

2019.3.29

试剂、试剂盒	乙腈 α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA)α-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）氨基黑封端（capping)试剂考马斯亮蓝 R250 HCl 石蜡油 PBS-Tween Tris-Cl 胰酶凝胶电泳试剂
仪器、耗材	电转膜仪电泳系统 IAV膜 MALDI 样品板质谱仪 PVDF 膜旋转杂交仪 UV 可见分光光度计水浴锅
实验步骤	一、IAV-胰酶膜的制备二、固定化胰酶活性的检测三、凝胶电泳分离蛋白质四、胶的染色五、蛋白质双平行消化六、膜结合蛋白的染色（本步骤为选做）将 PVDF 膜用 0.5% 的氨基黑染色 1 mm，然后用水脱色。七、PMF 数据的采集八、蛋白质的鉴定 1.使用质谱仪的采集软件，设置质量峰的检测阈值，该值是针对一组校准过的图谱而优化获得的（相应标准参见表 8.9 和表 8.10)。然后将 MALDI 板上的位置转换成相应的表观分子量（Mr) 和等电点（pI）。已经开发出了使鉴定过程自动化的工具（Gras,et al，1999;Perkins，et al，1999)。 2.整合 PMF 及计算出的表观分子量、等电点等数据，并设置相应的肽质量误差 711 围和化学修饰参数，然后将整合的所有数据自动提交到 SmartIdent(http://ch.expasy.org./tools/)。鉴定过程必须考虑到弱表达的蛋白质及重叠的蛋白质斑点，因此 PMF 搜索的最小肽段匹配数应该尽可能少（即 3 个肽段）。未酶切位点设为 1。在任何情况下，那些带有未酶切位点的肽段或有人工修饰（如丙酰胺半胱氨基，proionamidecysteine) 的肽段，对最终得分的贡献都少于那些没有未酶切位点和未修饰的肽段。众所周知，MALDI 样品板上的质谱采集位点影响质量的准确性（Egelhofer，etal，2000)。此外，粘到 MALDI 板上的膜的微弱翘曲也会导致误差。所以，预期的质量误差会高达〇.6Da，通常这不至于影响蛋白质的鉴定，因为 SmartIdent 工具通常能够对校对误差给予补偿。 3.将质量峰列表和鉴定结果转换成 text 文件。九、建立真实图像按照 Bienvenut 等（2001) 介绍的程序分析归类所鉴定的蛋白质。以下一些标准可用于从鉴定结果中找出、排除错误结果：（1）同一种蛋白质的鉴定结果应该集中在 2D 凝胶上的某一点的区域范围内，因此，如果鉴定结果分数在膜的一个比较大的区域，则应该予以排除。（2）鉴定结果需要基质峰或污染峰相匹配的，则其结果应予排除；同样，弱表达的蛋白质鉴定时，如果匹配的是高丰度蛋白质的肽段，则也应排除。（3）平均得分低的鉴定结果必须舍弃展开

试剂、试剂盒

乙腈 α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA)α-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）氨基黑封端（capping)试剂考马斯亮蓝 R250 HCl 石蜡油 PBS-Tween Tris-Cl 胰酶凝胶电泳试剂

仪器、耗材

电转膜仪电泳系统 IAV膜 MALDI 样品板质谱仪 PVDF 膜旋转杂交仪 UV 可见分光光度计水浴锅

实验步骤

一、IAV-胰酶膜的制备

二、固定化胰酶活性的检测

三、凝胶电泳分离蛋白质

四、胶的染色

五、蛋白质双平行消化

六、膜结合蛋白的染色（本步骤为选做）

将 PVDF 膜用 0.5% 的氨基黑染色 1 mm，然后用水脱色。

七、PMF 数据的采集

八、蛋白质的鉴定

1.使用质谱仪的采集软件，设置质量峰的检测阈值，该值是针对一组校准过的图谱而优化获得的（相应标准参见表 8.9 和表 8.10)。然后将 MALDI 板上的位置转换成相应的表观分子量（Mr) 和等电点（pI）。

已经开发出了使鉴定过程自动化的工具（Gras,et al，1999;Perkins，et al，1999)。

2.整合 PMF 及计算出的表观分子量、等电点等数据，并设置相应的肽质量误差 711 围和化学修饰参数，然后将整合的所有数据自动提交到 SmartIdent(http://ch.expasy.org./tools/)。

鉴定过程必须考虑到弱表达的蛋白质及重叠的蛋白质斑点，因此 PMF 搜索的最小肽段匹配数应该尽可能少（即 3 个肽段）。未酶切位点设为 1。在任何情况下，那些带有未酶切位点的肽段或有人工修饰（如丙酰胺半胱氨基，proionamidecysteine) 的肽段，对最终得分的贡献都少于那些没有未酶切位点和未修饰的肽段。众所周知，MALDI 样品板上的质谱采集位点影响质量的准确性（Egelhofer，etal，2000)。此外，粘到 MALDI 板上的膜的微弱翘曲也会导致误差。所以，预期的质量误差会高达〇.6Da，通常这不至于影响蛋白质的鉴定，因为 SmartIdent 工具通常能够对校对误差给予补偿。

3.将质量峰列表和鉴定结果转换成 text 文件。