藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白...-2
3.结果分析:
实验测得的藻蓝蛋白纯度只有0.509，比较我们班其他组的结果相差不算太大，但其他班有的组测得藻蓝蛋白得纯度可达到 1.7左右，相对于这个纯度，我们所提取得藻蓝蛋白纯度时偏低的，影响藻蓝蛋白纯度的原因主要有以下几个：
1)冻融次数:本实验时采用冻融法破碎细胞，冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。每次冻融最容易生成细小冰晶体的地方是不一样的，即在细胞内外形成冰晶的部位是不同的，这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏，因而多次冻融能使破碎效果提高。冻融时间增加随能使冰晶体变大，但由于受细胞内外水分含量的限制，冰晶的长大使有限度的，因而对细胞壁和细胞膜破坏只是在原有基础上的破坏，破坏区域较少，效果较差，所以冻融时间对冻融效果影响不大。可见，在冻融法中次数对藻蓝蛋白得率得影响比时间对它得影响大，多次反复冻融的细胞破碎效果比较好。我们自己只冻融了一次，其余是老师整体冻融的，所以我们冻融方面应与其他组没有多大区别。
2)不同饱和度硫酸铵的盐析效果：实验过程中，饱和度在20％时，没有明显的沉淀，查资料得知，当饱和度在25％以下时，没有明显的沉淀，在25％以上后，随着硫酸铵饱和度的增加，提取率逐步升高。从纯度看，随着饱和度的升高，纯度先降后升。实验测得的结果偏低，可能是加入硫酸铵过程中，随着饱和度的增大，杂蛋白，藻红蛋白和别藻蓝蛋白沉淀出的量都在增大，藻蓝蛋白所占的比例减小，所以纯度减小。由于我们过柱时取的样不是我们组的，所以无法考证是这两种原因引起我们结果偏低，只能说这两种原因对我们所得的藻蓝蛋白纯度会有影响。至于影响的大小，取决于各组的操作。
3)装柱：装柱的好坏直接影响到实验结果，将DEAE－纤维素溶液倒入层析柱后，并保持水面高于柱面1～2cm，若液面水不足，则可能使柱间出现断层，影响下一步的过柱。
4)过柱：用胶头滴管吸取透析后的藻蓝蛋白粗提液，伸入柱液面内，沿管壁以很慢的速度将粗提液滴到液面中部，待液面升高后可以加快滴加速度。待粗提液液面比填料高出大约只有1cm时，用少量的
0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲洗管壁，待填料上面的溶液澄清，无明显蓝色时，再分次加入50ml，0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲。
由各管光吸收值曲线图可看出，我们接样时间较晚，第一管光吸收值已达1.290，应该再蓝色离柱底1cm左右时开始接样，而我们是等到差不多见到样液显蓝色时才接样，所以曲线不是两边对称的。在测各管光吸收值时，由连续5管在2.590左右，而我们只是拿最高即第四管，光吸收值为2.600那管测其藻蓝蛋白纯度，也许在其他管中，藻蓝蛋白纯度较高，因为这几管的光吸收值偏差很小。
七、实验总结及分析
1．螺旋藻是一种多细胞丝状蓝藻，螺旋藻是蓝藻门颤藻科的单细胞藻类，内含一种特殊的色素蛋白——藻蓝蛋白，约占藻体干重的10％——24.8％。据报道，藻蓝蛋白可提高人体免疫机能、增强造血功能，可用作肿瘤、贫血等疾病的辅助治疗药剂；螺旋藻蓝蛋白的水溶液呈泽蓝色。藻胆蛋白主要有藻蓝蛋白（简称CPC）、藻红蛋白、异藻蓝蛋白（简称APC）和藻红蓝蛋白四大类。螺旋藻中是以
CPC和APC为主。从藻蓝蛋白三维结构而言，是由a—和p—亚基构成，每个亚单位有1——2个被称为“藻胆素”发色基组成。螺旋藻为蓝藻的一个属，含有多种营养成分，具有营养及医疗保健功能，它被世界粮农组织（FAO）誉为21世纪人类最理想、最完美的食品。螺旋藻中尤以蛋白质含量最为丰富，是大豆蛋白质的两倍，是目前已知植物中蛋白质含量最高的一种。它由18种氨基酸组成，氨基酸组成合理并含有人体所必需的8种氨基酸。但是，目前，螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，由于受其溶解性质的局限性，使其应用受到一定的限制螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻,因含有多种对人体有益的营养物质而受到广泛的关注,其突出特点是氨基酸种类齐全且蛋白质含量高,其中含量最高的藻蓝蛋白(PC)和别藻蓝蛋白(APC)一直是基础研究的热点,因为它们不仅在光合作用的原初反应机理的探索方面有重要意义,而且可以作为生物体内的荧光示踪物质,作为天然的色素蛋白也具有十分广阔的应用前景。但由于分离纯化的困难,现有的藻胆蛋白商品价格昂贵,使它的应用受到了一定的限制。
2．实验可以分为三大步骤：细胞破碎、粗提取、过柱纯化。细胞破碎方法有：反复冻融法、
化学试剂处理法、溶胀法、超声波法、组织捣碎法等；粗提取方法有：盐析法、结晶法、等电点沉淀法、超滤法等；纯化方法有：DEAE—纤维素离子交换柱法、羟基磷灰石柱层析法、
葡萄糖凝胶柱层析法等。我们的实验是采用冻融法破碎细胞，盐析法进行粗提，DEAE—纤维素离子交换柱法进行纯化。
3．我们实验得到的A620/A280＝0.
509。参考各方面的文献资料，若基本按照我们的实验操作方法，得到的A620/A280<2，其他组最高也有1.8
左右，表明我组的实验过程存在一定的不足，我觉得关键是纯化过程做得不好，如柱子装得不直，填料上下密度不均，上样时没有关闭开关，滴加速度太快等。
4．根据我查找的论文，在纯化这一步骤采用多种类型的层析柱进行纯化后，A620/A280最高值可以达到14。因此我建议03级再做这个实验时，到纯化时，可以加多一条羟基磷灰石柱、葡萄糖凝胶柱与DEAE—纤维素离子交换柱结合使用，实验结果得到的纯化结果会大大提高。
