藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白...-1
一、实验目的
学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度的方法
二、实验材料
螺旋藻藻粉
三、实验设备
天平，量筒，塑料杯，药匙，小烧杯（5个），铁架台，铁夹，玻棒（若干），胶头滴管（若干），滤纸，收集器，树脂柱，梯度洗脱器，蠕动，磁力搅拌器，高速离心机
四、实验原理
1.冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此重复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2.盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶)，但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。
3.DEAE－纤维素：英文名称 DEAE－Cellulose，二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基.弱碱性阴离子交换剂。
原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换。性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
4.葡萄聚糖凝胶：商品名称Sephadex，是效果较好的分子筛凝胶层析。
原理：分子筛指多孔介质。小分子能进入介质内部空隙，大分子物质排阻在介质之外，从而达到分离目的，这种作用为“分子筛效应”。
5.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装和湿装两种。干装法是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随机将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶液慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降至需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。
6.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2(体积越小越有利于提高分辨率)。
7.洗脱：待样品液的液面流到固体相表面时，用滴管加入洗脱剂(5cm)，并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。
洗脱流速：如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全，如果太慢，洗脱物会扩散。
8.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液样品的浓度或活性为纵坐标)。
五、实验步骤
1.取螺旋藻粉颗粒20粒，每颗0.5g,一共取藻粉0.5g/粒×20=10g，倒入塑料瓶中，加提取液100ml。
2.将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。如此反复冻融多次（实验中此步骤我们只做了一次，其余由老师帮做）,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。
实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液
3.冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min，得到亮蓝色上清液 67.8ml，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。
4.称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末8.72g，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到20％。在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得亮蓝色上清液67.2ml，弃去蓝色沉淀。
5.称取之前已经研磨好的
(NH4)2SO4固体粉末12.7g，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4浓度达到50％。在10000rpm下高速离心15min，离心沉降后，取得深蓝色沉淀，弃去黄绿色上清液。加不超过15ml蒸馏水溶解所得沉淀备用(水因尽量少,有利于渗析)。
6.剪取约25cm长的层析袋，放入烧杯中煮沸5min（从水沸开始计时），将其中一头用细线扎住，对折后再用细线扎住。将之前溶解沉淀的溶液倒入层析袋中。放入蒸馏水中，4℃ 下透析2—3天。
7.取一支层析柱，检漏后清洗干净，用两个铁夹固定在铁架台上，要从正面和侧面检查是否竖直，如不竖直则作出调整。称取
40gDEAE—纤维素—52于一烧杯，加150ml0.5MHCL溶液，轻搅,浸20min，小心倒掉上清液，补水到同一刻度，轻轻搅拌溶液，均匀地倒入柱中。柱中液面上要保留2～3cm的空间，之后液面每下移到原刻度位置，就补水到相应高度，使蒸馏水始终高于填料2cm以上。
8.以下由老师完成。用0.5MNaCL__0.5MNaOH溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。接着用0.5MHCL溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。后用0.5MNaCL__0.5MNaOH溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。最后用0.02M，pH6.5磷酸缓冲液平衡过夜。至此，层析柱准备完毕。
9.剪一片刚好可以覆盖填料平面的滤纸，轻放入填料面。将准备好的层析柱中的缓冲液放出，待液面比填料高出大约只有1cm
时，关闭柱开关。用胶头滴管吸取透析后的藻蓝蛋白粗提液，伸入柱液面内，沿管壁以很慢的速度将粗提液滴到液面中部，待液面升高后可以加快滴加速度。待液面离柱口只有大约2cm距离时，把开关完全打开，一边继续滴加粗提液。
现象：开始有颜色分层，由上到下分别为蓝色，绿色，黄色
10.待粗提液液面比填料高出大约只有1cm时，滴加50ml，0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲洗残余粗提液，不要一次加入，应先加少量把残余粗提液冲洗干净
(至溶液澄清为止)，再大量加入。最后加入0.5MNaCL—0.02M，Ph6.5磷酸缓冲液（流速：1.0ml/min）。
第一次洗脱后现象：洗脱一段时间后出现红色层，最后出现明显的四个分层，由上到下分别为蓝色，绿色，青色，粉红色。
11.小心观测，待有浅蓝色溶液流出时，马上开始收集，5ml一管（共收集了14管）。由于气温较高，边收集边将收集好的溶液倒入试管，用滤纸封口，排好顺序,贴上标签4℃保存待测。
收集到试管后，试管内溶液的颜色变化：浅→深→浅
12.取出冷冻保存的试管，以磷酸缓冲溶液为空白对照管,用分光光度计测其OD620nm,。实验结果见表1。
13.根据A620nm可知，蛋白含量最高为第4管，取该管溶液稀释后用紫外可见光谱仪作200nm～700nm扫描,测藻蓝蛋白纯度。实验结果见表2及附件。
六、 实验结果
1. 表1：过柱后收集的提取液OD620nm
|
管号 |
A620nm |
|
1 |
1.290 |
|
2 |
2.345 |
|
3 |
2.590 |
|
4 |
2.600 |
|
5 |
2.592 |
|
6 |
2.592 |
|
7 |
2.591 |
|
8 |
2.011 |
|
9 |
0.516 |
|
10 |
0.337 |
|
11 |
0.223 |
|
12 |
0.192 |
| 13 | 0.187 |
| 14 | 0.166 |
2. 表2紫外可见光谱仪测藻蓝蛋白纯度
| 管号 | A280 | A620 | A620/A280 |
| 4 | 1.206 | 0.614 | 0.509 |
-
科技前沿
-
焦点事件
