碱性磷酸酶的染色检测
实验概要
了解碱性磷酸酶的染色检测方法。
实验原理
本试验是一个酶组织化学试验,酶组织化学是在不破坏组织细胞的条件下,检测酶的存在,定位与活性的学科,即在酶的存在,分布及其用在显微镜下变成可见的。生命是有序的,包括时间的有序及其空间的有序。其中美的空间有序性在于其细胞组织结构的精确位置,各种酶的自己的位置保证了化学活动的有效进行。
酶的定位方法必须准确,其显示方法必须具有高度的特异性,使酶本身具有可见性,这是一种直接的方法,目前主要有免疫荧光化学法,该法敏感性高,速度快,但成本高。如果有相同的抗原决定簇时,则会有交叉反应。方法成熟,使用广泛的还是经典的组织化学方法。下面以碱性磷酸酶的显示方法来学习经典酶组织化学的理论及操作。经典酶组织化学不是显示酶本身,常采用的方法是:在一定条件下,使细胞中的酶作用于酶的底物,使其产物在原地进行捕捉、沉淀转化为有色产物。碱性磷酸酶(AKP)的显示方法最早由Gomeri(1939)提出,现在这种方法称为Gomeri法。碱性磷酸酶是指磷酸单酯酶Ⅰ,它能在pH8.6~10.0的最适条件下分解磷酸单酯,对于与磷酸相接的醇基没有特异性,Gomeri法是让该酶在碱性条件下,分解甘油磷酸钠,产生磷酸根。
在孵育液中加入CaCl2,分解产生的磷酸根离子立即被Ca2 原位捕捉形成沉淀。
HPO2-- Ca2 →→CaHPO4 ↓(无色沉淀)
因出现的是无色沉淀,故还不能在光镜下观察到,尚需转化为有色沉淀,先让制片与Co(NO3)2反应生成磷酸钴:
CaHPO4 Co(NO3)2 →→CoHPO4 ↓(无色沉淀) Ca(NO3)2
再让它与硫化铵反应生成黑色的硫化钴沉淀。
CoHPO4 (NH4)2S→→(NH4)2HPO4 CoS ↓(黑色沉淀)
我们可以在显微镜下观察到黑色沉淀的位置,由于以上的这些操作都是在原位进行的,可以认为黑色沉淀的位置就是酶所在的位置,这类方法是让酶作用于底物而将酶显示出来。因此制作酶组织切片的时候不能使酶失活,还要尽量避免酶所需的反应的产物扩散,否则不会得到正确的结果。
主要试剂
1. 二甲苯
2. 无水乙醇
3. 95%乙醇
4. 90%乙醇
5. 70%乙醇
6. 30%乙醇
7. 3% 甘油磷酸钠
8. 2%巴比妥液
9. 2% 氯化钙
10. 2%硫酸镁
11. 2%硫化铵(45ml蒸馏水 硫化铵6-7滴)
12. 2%硝酸钴
13. AKP作用液:
3%甘油磷酸钠 10ml
2%巴比妥液 10ml
2%氯化钙 2 ml
2%硫酸镁 1 ml
蒸馏水 20 ml
主要设备
1. 立式染缸 12个
2. 镊子 2把
3. 量筒 25ml 1个
10ml 1个
4. 恒温水浴(37°C) 1个
5. 沸水浴 1个
6. 电炉 1个
实验材料
组织制备
1. 取材:取动物肾、小肠等大块组织,大小约2-3mm
2. 固定:将取下的材料迅速在冷丙酮中固定24小时(一直在4°C中进行),中间换冷丙酮4次
3. 包埋:将固定好的材料,用纯酒精脱水30分钟(中间交换一次),二甲苯透明(20分钟),用快速法把材料包埋于石蜡中(用低熔点的石蜡)
4. 切片:切片5~6µ,在37°C以下的温水中展片,将蜡片粘于涂有蛋白胶的载波片上
5. 把切片置于37°C温箱种干燥小时
6. 将切片置于4°C的冰箱,直至试验前才取出
实验步骤
1. 每人取已粘好烘干的鼠肾切片两块,放入二甲苯(一)→→二甲苯(二)(各3-4分钟)的染缸中进行脱蜡,再经100%乙醇(一)→→100%乙醇(二)→→95%乙醇→→90%乙醇→→70%乙醇→→30%乙醇→→水。每级各一分钟,在移切片时,用镊子夹住切片震荡并提起,放下反复几次,在移入下一染缸边缘前稍停留,让溶液滴净后,再入下一染缸,以免把上一染缸溶液过多带入下一染缸,而影响切片质量;
2. 将其中一块切片以蜡笔作一标记(用作对照组切片),放入沸水中煮沸5分钟;
3. 将两块切片均放入AKP作用液中孵育30-60分钟,作用液要事先预热到37°C,水浴中进行;
4. 取出切片在蒸馏水中洗涤;
5. 放入硝酸钴溶液2-3分钟;
6. 蒸馏水冲洗干净,否则切片易被污染,影响定位;
7. 切片浸入硫化铵中2-3分钟;
8. 蒸馏水冲洗干净;
9. 经各级酒精脱水。即30%乙醇→→70%乙醇→→90%乙醇→→950%乙醇→→100%乙醇(二)→→100%乙醇(一),各级一分钟。
注意事项
观察结果:
在显微镜下观察,细胞中有黑色沉淀存在的地方,就表明有酶的存在。煮沸的对照切片无黑色沉淀。