体细胞杂交的实验方法介绍
所有操作均在超净工作台上进行。
1．原生质体的分离和收集。
2．将收集的两种不同材料的原生质体分别悬浮在0.16mol/L的CaCl2·2H2O（pH5.8~6.2）原生质体密度调整为2×105/ml左右（用血细胞计数板统计原生质体密度）。
3．将两种原生质体悬液等量混合。
4．用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿滴7~8滴，每滴约0.1ml。然后静置10in，使原生质体巾在皿底上，形成一薄层。（应有3~5个平皿的重复）。
5．用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10~15min。此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。
6．用刻度吸管向原生质体液滴慢慢地加入高pH、商钙稀液。第一次加0.5ml，第2次1ml，第3、4次各2ml，每次之间间隔5min。
7.将平皿稍微倾斜，吸去上清液，再缓缓加入4ml稀释液。5min后，再倾斜平皿，吸去上清液注意吸去上清液时勿使原生质体漂浮起来。
8.用DPD培养基如上法换洗二次。
9.每平皿中加培养基2ml，轻轻摇动平皿。
10.用蜡膜密封平皿。置260下进行24h暗培养，然后转到弱光条件下培养。
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