人肺癌裸鼠原位移植模型的建立实验——外科原位移植法
人肺癌裸鼠原位移植模型的建立可用于：（1）建立一个良好的肺癌动物实验研究平台；（2）实时监测原发肿瘤的生长和转移；（3）在细胞和分子水平对活体内的生理和病理过程进行定性或定量可视化观察。
| 实验方法原理 | 利用逆转录病毒转染法将增强型绿色荧光蛋白基因导入人肺癌大细胞系NCI-H460，采用外科原位移植法建立肺癌原位移植模型。定期通过小动物活体荧光成像系统观察肿瘤生长，利用相关性检验分析荧光面积和肿瘤体积之间的相关关系，并观察原位移植术后裸鼠的生存期和肿瘤转移情况。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、 实验材料准备
二、 表达绿色荧光蛋白的H460肺癌细胞系的建立 1. 在含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的RPM1-1640上清液中培养PT67包装细胞。
三、原位移植模型的建立 1. 将H460-GFP细胞悬浮于PBS液中，调整细胞浓度为5x106/mL。 四、 监测指标
1. 术后每天观察裸鼠有无并发症及异常情况（活动，神经功能，呼吸，动物外观）。
五、统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，荧光面积和肿瘤体积用Mean±SD表示，Pearson相关性检验分析活体肿瘤面积与肿瘤体积之间的相关性，以P<0.05为差异具有统计学意义。 展开 |
| 注意事项 | 1．要设计不同的实验组和对照组， 每组动物数一般为 5-10 只； 2．一般接种肿瘤6-8 周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为 15-20mm ( 即小鼠会濒临死亡) 时， 可眼球取血，分离血清并保存血清， 处死小鼠， 取肿瘤组织照相， 取部分肿瘤组织作 冰冻组织切片( 或- 80℃ 保存)， 作相应的免疫组织化学染色 ， 取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定， 石腊包埋， 作常规HE 染色。 |
| 其他 | 一、实验讨论
1994年Chalfie等首次在大肠埃希菌和线虫中表达GFP，开创了GFP应用研究的先河。近年来，绿色荧光蛋白已成为应用最为广泛的标记性蛋白质之一。GFP基因表达的绿色荧光蛋白受到蓝光或紫光照射时可自发地发出绿色荧光，荧光信号强度高，易于被捕获，无需其它底物或辅助因子的协助便可直接通过荧光显微镜或流式细胞仪等进行检测，观察直观方便；同时，还具有稳定性好、耐受性强、对组织或细胞无毒性和易于构建载体等优点。因此，GFP在肿瘤的生长、疗效评价等方面均已获得广泛应用。
活体动物体内光学成像技术将GFP基因直接转染至肿瘤细胞，根据荧光蛋白的观测和定量分析直接反映研究细胞的生物学特性。荧光蛋白内在的生色团，在简单的仪器如带有窄带过滤片和激发滤波片的蓝色发光二极管照射下，能发射蓝色激发光，激发荧光蛋白发光。观察者通过合适的看片灯和约490 nm波长的导光纤维光转移。随着研究人员对荧光蛋白的深入探讨，发现发射光谱在近红外波段的荧光蛋白更适合深部动物组织成像。红色荧光蛋白产生的荧光显像将更敏感，周围组织的吸收和散射减少。目前已发现的最亮的荧光蛋白是一种叫Katushka的红色荧光蛋白，发射波长超过620 nm，具有快速成熟、高pH稳定性和光稳定性的特点，将来可能会使肺部肿瘤活体动物的非侵入全身成像成为现实。
综上所述，本实验利用SOI法构建的表达绿色荧光蛋白的肺癌裸鼠原位模型，通过观察绿色荧光蛋白能够客观评价NCI-H460-EGFP细胞在裸小鼠体内的生长情况，从而发现肉眼无法发现的微小转移灶，在探索肺癌的生长、转移等机制的研究中有重要的价值。同时本研究还证实了在该模型中可以通过测量荧光面积推测肿瘤体积，从而定量分析肿瘤在体内的生长情况，为药物治疗的临床前研究提供新的实验工具。 展开 |
