人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验
实验方法原理 将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准处死。HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。利用KODAK IS2000MM系统检测肿瘤播散情况。
实验材料 BALB c nu nu裸鼠腺癌细胞株A549
试剂、试剂盒 小牛血清RPMI-1640培养液pRNAT-U6 Neo磷酸钙即用型SP超敏 感免疫组化染色试剂盒DAB Kit 显色试剂盒甲醛EDTA戊巴比妥钠
仪器、耗材 荧光显微镜光学显微镜
实验步骤
一、实验材料准备
1. BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周龄，体重18-20 g，无特定病原体(SPF)级饲养。
2. 肺腺癌细胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibcobrl公司)，5% CO237℃培养，常规传代。
3. 质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo(美国Genscript公司)，携带Neomycin耐药基因供筛选，在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。G418(美国Promega公司)800 μg/ml初筛后200 μg/ml维持筛选。
二、细胞的转染
1. 哺乳动物磷酸钙转染系统(美国Promega公司)，按照操作指南将质粒pRNAT-U6/Neoo转入A549细胞，转染后24~48 h荧光显微镜下观察转染效率。
2. 后培养液内加G418筛选获得稳定转染。
3. 利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率>10%后，有限稀释法获得表达GFP阳性细胞。
4. 1月后收获转染细胞，常规传代培养，培养液中加G418(200 μg/ml)维持筛选。
5. 测定转染后A549细胞增殖动力学指标，对比转染前后A549细胞生长曲线，检测转染后细胞的生长活性是否受转染的影响。
6. 待细胞增殖达一定数量后，裸鼠皮下注射转染前后细胞，记录成瘤时间，用公式V=1/2×长×宽 计算肿瘤体积，对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差别。
三、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立
1. 取转染后细胞，用不含血清的RMPI 1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为5×106/0.2 ml备用。
2. 用0.5%的戊巴比妥钠(50 mg/kg)(中国医药上海化学试剂公司)腹腔注射麻醉裸鼠，用26号针头吸取细胞悬液0.2 ml注射入裸鼠左侧胸腔，注射过程中注意控制刺入针头的深度。
3. 整个操作过程在细胞收获后半小时内完成，严格遵循无菌原则。
4. 注射后在KODAK IS2000MM下确认原位种植成功，注射部位为胸腔。
5. 注射后继续饲养，隔天观察一次并记录体重。
6. 当裸鼠出现精神萎靡、呼吸短促、弓背并明显消瘦，体重较注射Et减轻20%时，颈椎脱位术处死裸鼠。
7. 开胸观察，取出器官，用10%甲醛固定保存。
四、检查项目
1. 转染后细胞荧光显微镜成像转染后24～48 h荧光显微镜下观察，确认转染成功。单克隆化过程中镜下观察细胞克隆生长情况。
2. 活体GFP标记成像检测应用KODAK IS2000MM进行活体荧光成像，确认注射部位为胸腔，后间断应用以活体确认瘤细胞的远处转移。
3. 解剖学与组织学检查处死的裸鼠均经
详细解剖学检查，取出器官、固定包埋后，以4 tun厚度连续切片，切片严格编号，奇数号行HE染色，光镜观察，以初步确定转移灶。
4. 免疫组织化学染色
选择肺脏、肝脏和脑作为主要研究器官，在HE染色确定转移灶位置的基础上，取相邻偶数号码的切片进行免疫组化检测，CEA鼠抗人单克隆抗体(ZM-0062)，LRP鼠抗人单克隆抗体(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫组化染色试剂盒(sP-9000)、抗原修复液、DAB Kit显色试剂盒(zU一9032)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
五、统计学处理
细胞的生长活性和肿瘤体积x±s表示，数值的比较采用方差分析。HE检测结果和活体成像检测结果的比较用x2检验。采用SPSSl3．0软件进行统计分析。
其他
一、实验讨论
基于肿瘤生长、侵袭和转移的“种子和土壤”学说，肿瘤细胞在体内的生长和播散具有器官特异性。原位种植法模拟肺癌发生的自然环境，是建立肺癌转移模型的最佳方法。肿瘤学研究中应用最多的皮下种植法建立的模型只是局部包块而无远处器官的转移和播散，不出现肿瘤相关症状。McLemom等最早用支气管内注射的方法在裸鼠右肺内建立了人肺癌原位模型：肿瘤的生长较皮下种植法广泛，但播散仅限于右肺内，未发展有远处转移时裸鼠就因肺内病变而死亡，同时技术条件要求较高，手术相关死亡率高达5%，用来建立NSCLC转移模型可行性差。本研究采用胸腔内原位注射法，操作较支气管内注射法简单可行，手术死亡率低，种植部位为肺内，模拟临床NSCLC转移的自然发生情形，兼顾实验的可行性和可信性，表现出和临床相像的晚期NSCLC系列症状，和临床相似的肝、脑转移率，病理解剖过程中观察到的体内播散也和临床吻合，证实胸腔内原位注射法适合用于建立NSCLC转移模型。
原位种植法建立的模型为体内深部组织生长，肿瘤生长和播散的检测和评价较困难。常规采用每隔几天处死一定数量裸鼠后行病理分析，来检测肿瘤的生长和播散，这种方法需要较多裸鼠，而且耗费大量时间和精力。KODAK IinageStation 2000MM是KODAK公司运用近红外成像技术制造的一套多功能成像系统，它利用内置的紫外epi．illumination(300～400 nm)光源及多达6种不同的滤光片高效率激发各种荧光标记物。本研究中将携带GFP的质粒转染人人肺腺癌细胞株A549作生物示踪，细胞生长活性和成瘤性均未受转染的影响，显像时无需注射底物即检测肿瘤的侵袭和播散。这种检测方法显著简化了上述常规方法，在多个方面有益于对所建模型的评价：①在最初注射时即可用来确认注射部位的准确性和注射细胞数量的精确性；②因为种植后产生的转瘤在数目和体积上有差异，通过这种体内成像系统能选择最有代表性的靶病灶；③无须处死裸鼠即可非侵人性、无创性、体外实时显像评价肿瘤在体内的播散和远处转移；④选择公认的全身严重衰竭、呼吸短促、体重减轻20%为裸鼠处死标准，而不是常规的绘制Kaplan—Meier生长曲线，应用小数量的裸鼠即可获得有意义的统计学结果，大幅减少了研究人员的工作量。统计学分析证实其肝转移和脑转移检测结果与病理检测结果无差异，说明利用这种方法检测肺癌远处转移结果可信。
胸腔内原位种植法操作简便，重现临床NSCLC转移过程；GFP转入人肺腺癌A549细胞对生长活性和致瘤性无影响，A549/GFP用于NSCLC转移模型结果可靠；借助于荧光显像设备，利用GFP的示踪功能可以非侵人性检测NSCLC转移。
