核糖核酸探针
核糖核酸探针
1.室温下,于1.5ml无菌微量离心管内依次加入:
5μl 5×转录缓冲液
1μg 模板DNA
1.2μl 10 mmol/L rATP(终浓度为480μmol/L)
1.2μl 10 mmol/L rCTP(终浓度为480μmol/L)
1.2μl 10 mmol/L rGTP(终浓度为480μmol/L)
1μl 1 mmol/L UTP(终浓度为40μmol/L)
1μl 0.75 mol/L 二硫苏糖醇
1μl RNase Block Ⅱ或0.5μl RNasin
5μl α-[32P]UTP(2.5μmol/L终浓度,DEPC水加至25μl)
1μl T3, T7或SP6 RNA聚合酶(10U)
2.37~40℃温育60min。
3.若不做凝胶纯化步骤,则:
a. 加入1μl无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶并在37℃温育15min。
b. 加DEPC处理水将体积增至100μl。加100μl苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液再提取一次。
c. 再加入100μl氯仿:异戊醇(24:1)溶液再提取一次。
d. 加0.5倍体积7.5mol/L乙酸铵及2倍体积乙醇,置干冰中30min。
e. 10 000×g离心至少5 min(去除上清液并用盖革计数器监控)。
f. 用100μl 1mol/L乙酸铵重悬沉淀小团,重复d~e步骤。
g. 真空(真空旋转蒸发/浓缩仪)干燥沉淀小团,用DEPC水重悬沉淀小团,取1μl置液闪仪计数。
4.若需做凝胶纯化,则:
a. 将无RQ1 RNA酶的DNA酶处理步骤省去。
b. 制备测序凝胶(5%聚丙烯酰胺/6mol/L 尿素)
c. 加DEPC水将核糖核酸探针溶液体积增加至100μl,100μl苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液提取一次,100μl氯仿:异戊醇(24:1)再提取一次。
d. 加0.5倍体积7.5mol/L乙酸铵,加2倍体积乙醇置干冰30分钟。
e. 10 000×g离心至少5min(去除上清液,并用盖革计数仪监控),真空干燥,用5μl DEPC水重悬沉淀。
f. 加10μl上样缓冲液,全部的样品上样电泳(样品上样前加热到85℃ 5min即置入冰中),在60W条件下至少电泳1.5h。
g. 去除玻璃板,用塑料薄膜包裹凝胶,X射线胶片曝光30~60s,核糖核酸探针所处位置呈现自显影像,用剃须刀准确切下相应凝胶条带。
h. 凝胶条用400μl洗脱缓冲液,37℃下,连续振荡洗脱4h。洗脱液移入干净离心管,盖革计数器检测洗脱液及凝胶条块(洗脱液中计数值应高于凝胶条)。
i. 加1μl冰冷乙醇并静置冰浴15min。
j. 10 000×g离心15min,乙醇沉淀。RNA沉淀用DEPC水再溶解,取1μl置液闪仪计数。