石蜡切片或细胞的原位杂交实验
实验材料 | 石蜡切片 |
---|---|
试剂、试剂盒 | HCl 二甲苯 乙醇 SSC PBS 链霉蛋白酶 甘氨酸 DTT RNA酶消化液 乙酸铵 |
仪器、耗材 | 染色盘 加湿盒 载玻片 烘箱 水浴锅 培养箱 |
实验步骤 |
1. 准备脱蜡/再水化系统(可重复使用数次)及0.2 mol/l HCl同时,将载有切片样品的载玻片(玻片盒中,于-20℃或-70℃贮存)置室温。开始预热2×SSC至70℃(步骤5中使用)。
2. 在加有二甲苯的染色盘中进行切片脱蜡,更换二甲苯3次,毎次同隔2 min(对载有未经包埋单细胞的玻片则无必要)。
6. 在新配制的4%PFA固定液中进行样品后固定,置室温5 min。于3×PBS中终止固定3 min,继以1×PBS浸2次,每次30 s。
8. 以新配制的封阻液进行封闭。置45℃水浴30 min,水浴时用铝箔覆盖(碘乙酰胺对光敏感)。
9. 室温下,以1×PBS浸洗2次,每次2 min。
10. 于新配制的TEA缓冲液中,平衡样品2 min,移玻片架于新的TEA缓冲液中,并加 乙酸酐至0.25%终浓度。快速混合,并在搅拌情况下,浸泡玻片5 min。再加乙酸酐至0.5%终浓度,再浸泡5 min。
12. 分别以50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇(2次)浸泡进行样品脱水。室温下,每次2 min(用步骤3乙醇溶液)。
13. 空气干燥样品(或于干燥器中干燥)继续实验前应确证样品绝对干燥,样品放在加有干燥剂的玻片盒中,于-70℃干贮过夜。
14. 离心乙醇沆淀的反链及正链35S标记的核酸探针以及S-核糖核酸探针竞争物。沉淀干后,以5 μl 无菌的5 mmol/l DTT溶解沉淀。加2.5 μl(反应的半量)S-核糖核酸探针竞争剂于反链及正链核糖核酸探计中。
16. 立即加足量杂交液A,使探针终浓度为0.3 μg/ml,充分混合。测定放射活性(期望放射活性计数值≥1×105 cpm/μl)。将管置 45℃水浴(杂交温度)。
17. 小心在标本上铺加适量探针(如用加样吸头,按20 μl/20 mm3 铺加,开始杂交)。
18. 置样品于加湿盒中(载玻片水平放置),加湿盒内加入加湿盒溶液A,于 45℃温育杂交适当时间。杂交时间可进行30 min~4
h(须平衡湿盒内液体并小心密封湿盒,因为如果样品干了,将导致高杂交本底出现,加湿盒溶液与杂交混合液的渗透压必须相同,以防止杂交液稀释或浓缩)。
21. 在55℃溶液A中洗2次,每次15 min 继续在55℃溶液B中洗2次,每次15 min。然后,室温下,以溶液C洗2次,每次2 min。
图一、杂交混合物在载玻片上的应用
24. 经以下各组液体中(毎次2 min)进行脱水处理:50%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸铵、70%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸铵、90%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸铵、100%乙醇。
展开 |
注意事项 |
1. 以上所有步骤均是将承有样品的载玻片置于玻片架中,并在盛有指定溶液的玻璃染色盘中进行,除非另有说明,所有溶液均为新配制,并只使用一次。
|
-
科技前沿
-
焦点事件
-
焦点事件
-
焦点事件
-
企业风采
-
焦点事件
-
焦点事件
-
项目成果
-
企业风采