荧光定量PCR技术特点、原理及其应用-2
3 应用
由于FQ-PCR具有高灵敏性，高特异性和高精确性的特点，目前，该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。
3.1 病原体测定
由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。
Morris等[3]用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。测定显示，可测得的样品浓度相当于每毫升13个基因组。与巢式PCR比较显示，FQ-PCR有着与巢式PCR相同的敏感性。另外，还对48例临床丙型肝炎病人血清样品进行了测试，32例样品两种检测方法均为阳性，10例均为阴性；另有6例用两种方法测定的结果不一致。该6例样品又让第三个实验室用巢式PCR方法重新测定，其结果与FQ-PCR测定的结果一致率为100%。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于FQ-
PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。
与宫颈癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒（HPV）有多种类型，以 HPV-16、18、31、33、35等类型危险性最高。Swan等[4]1997年用FQ-PCR技术对子宫阴道灌洗标本进行了研究。
他们发现，由于荧光探针的应用，对各型HPV的检测变得十分方便和准确。由于HPV-16的特异引物可以和HPV-66的模板DNA发生错配，用一般PCR方法扩增时，如有HPV-66存在，即可扩增出HPV-66片段而发生误诊，但是HPV-16特异探针的应用使HPV-66在TaqMan系统中不能扩增。因此，FQ-PCR对不同亚型的病毒检测具有高度特异性。同时也发现FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法检测不到的HPV模板浓度在TaqMan
系统中却可检测到。对于HPV-16、18、31、33、35类型敏感高达到每100～1000个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组，平均每300个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组。
以前常规检测大肠杆菌的方法，都是采用多种选择性培养基培养分离法，对产志贺氏毒素的大肠杆菌（SLTEC）缺乏特异性，因此这种菌株的检测又费时又困难。后来又有应用抗体的免疫学方法和核酸序列测定的生化方法及以DNA扩增为基础的PCR方法等，都因为繁琐，需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国Witham等[5]1996年将FQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和精确性。由于TaqMan系统可以一次测量96管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要进行电沪及EB染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。此外，加拿大Chen等[6]1997年也把FQ-
PCR技术用于食品中沙门氏杆菌的检测研究。
在抗痨治疗开始后，结核病人痰中可持续存在有结核杆菌，为了研究结核病人痰标本DNA定量结果是否与有活力的结核杆菌数量相符合并监测治疗反应，1998年美国Desardin等[7]用FQ-PCR和竞争性PCR两种方法定量检测治疗期间连续收集的结核病人痰标本，结果显示两种方法有较好的重复性和准确性。痰中结核杆菌DNA定量结果与抗酸染色显微镜下计数的结果一致。
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