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病毒RNA提取实验

2019.3.27

病毒RNA提取可以:(1)用于RNA病毒复制机制研究;(2)用于反向遗传学研究;(3)用于分子病毒学其他研究。

实验方法原理大多植物病毒RNA 为单链RNA ,并且其极性与mRNA 极性相同,植物病毒RNA 提取较为简单,一般使用酚氯仿即可获得满意结果。
实验材料

TMV病毒液

试剂、试剂盒

TE-饱和酚:氯仿氯仿NaAc乙醇TE缓冲液双菌水

仪器、耗材

冷冻台式离心机低温真空干燥仪电泳仪电泳槽

实验步骤

一、实验材料准备

1.  材料
 

提纯TMV病毒液(10 mg/ml)。
 

2.  设备
 

冷冻台式离心机,低温真空干燥仪,电泳仪,电泳槽。
 

3.  试剂
 

TE-饱和酚:氯仿(1:1),氯仿,3 M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE缓冲液,无RNA 酶的双菌水。
 

二、操作步骤
 

1.  取一eppendorf管加入提纯TMV(10 mg/ml)400 ml,再加入等体积酚/氯仿,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4℃下12 000 g离心10分钟。
 

2.  吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
 

3.  吸取水相于新eppendorf心管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4℃下12 000 g离心10分钟。
 

4.  取水相,加入1/10倍体积的3 mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
 

5.  4℃下12 000 g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12 000 g离心5分钟。
 

6.  小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。
 

7.  取10 ml进行电泳分析。

 

收起 
注意事项

1.  整个操作应尽可能在低温下进行。
 

2.  由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面,因此要充分剥去病毒外壳蛋白,一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。


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