动物骨髓中性粒细胞分离液试剂盒使用说明
各种动物骨髓中性粒细胞分离液试剂盒
规格：200 mL/kit
保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期 2 年。无菌开封后，保存于室温。
试剂盒组成：
试剂A 200mL
试剂C 100mL
细胞洗涤液 200mL
全血及组织稀释液 200mL
红细胞裂解液 100mL
操作步骤：
制备骨髓的单细胞悬液。
细胞悬液体积小于5mL时，在离心管中先加入4mL试剂A，后将2mL试剂C小心叠加于试剂A之上，形成梯度界面（细胞悬液体积大于等于5mL，试剂A与试剂C比例2：1，试剂总量与稀释后的样本量相等。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将细胞悬液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴
氏德吸管吸取细胞悬液，然后将细胞悬液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。）
3. 室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（细胞悬液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件
需摸索，离心转速最大不超过1200g）。
离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层细胞为单个核细胞层，下层细胞为中性粒细胞层，如图所示（个体差异或者是分离条件不同，粒细胞层可分离不明显）。
用吸管小心吸取试剂C与试剂A之间以及试剂A中的中性粒细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤细胞。250g，离心10min（如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液）。
弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心
10min。
重复步骤6
弃上清，细胞重悬备用。
骨髓单细胞悬液的制备方法
小动物骨髓的采集：
稀释液
单个核细胞层试剂C
中性粒细胞层试剂A
红细胞层
1. 处死动物，无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔（注意尽可能少的剪走骨髓腔）。
2. 取1ml的无菌注射器，吸取少量的含有10%标准胎牛血清的稀释液或者是含有血清的培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。
3. 最终制备成2×108–1×109/ml 的单细胞悬液备用。大动物骨髓的采集：
大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法：先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时即停止抽吸。用含10%标准胎牛血清的稀释液调整细胞浓度为2×108–1×109/ml 的单细胞悬液备用。
常用的骨髓穿刺点：
股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处； 胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处；
肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各点的中点；
胫骨：穿刺部位是股骨内侧、靠下端的凹面处。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺结束后要用胶布封贴穿刺孔，防止发生气胸。
注意事项：
A. 开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。。B. 分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。
C. 洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。D. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。
E. 如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在收集血液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。
F. 不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。
