免疫细胞的分离和保存技术
概述
临床上的各种类型的免疫缺陷、自身免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所显示的功能的强弱进行检测，是判断机体细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等方面均有重要意义。
第一节 免疫细胞的分离
用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液中分离出来。参与免疫的细胞主要包括：淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
一、白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为 600~1000：1，两者的比重不同其沉降速度也不同，通常用两种方法加以分离。
1、自然沉降法 外周血， 抗凝，静置约一小时血液分为三层，上层为血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为WBC，轻轻吸取此层即可得到富含WBC悬液，低渗破坏RBC，洗涤即可。
2、聚合物加速沉淀法
常利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐等，将红细胞快速沉降，从而分离出白细胞。本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离
人血液中各种细胞的密度如下：
红细胞：1.093
白细胞：1.092
淋巴细胞和单核细胞：1.075~1.090
血小板：1.030~1.035
单个核细胞包括：淋巴细胞和单核细胞。
分离血细胞常用的分离剂为：Ficoll和Percoll分离剂
1、 Ficoll分层液
主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll )其密度为1.020。可将血液分成四层，从上到下依次是：血浆、单个核细胞、粒细胞和红细胞。
2、 Percoll分层液
是一种连续密度梯度离心分离法，其主要成分为：硅胶颗粒，其原液密度为：1.135。可将血液分成四层，从上到下依次是：死亡细胞和血小板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞和红细胞。
第二节 淋巴细胞及其亚群的分离
1、纯淋巴细胞群的采集
原理：利用单核细胞在37℃和Ca离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度的淋巴细胞群。
(1)粘附贴壁法
因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。
(2) 吸附柱过滤法
将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的主要是淋巴细胞
(3)磁铁吸引法
利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞群。
(1)E 花环沉淀法
方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加入分层液→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。
（2）尼龙毛分离法
方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞
（3）亲合板结合分离法—分离亚群
方法：将所需的细胞对应的单克隆抗体包被于小管内→加入淋巴细胞→形成Ag-Ab复合物→洗去不反应的物质。
（4）荧光激活细胞分离仪法
荧光激活细胞分离仪(FACS)主要由4部分组成:细胞流动系统及气压流速控制系统;激发系统;检测与讯号处理系统;细胞分选系统。
其原理是：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。
（5）磁性微球分离法
磁性微球是将磁性材料颗粒表面进行外理，微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子材料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子物质（抗原、抗体、核酸等），若微球表面包被有免疫物质者称为免疫磁珠，其兼有免疫配基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场时磁性消除。目前商品出售的磁珠有直径为1~5um等不同的规格，表面活性基团有氨基（－NH2）、羧基（－COOH）和羟基（－OH）等，包被的免疫物质有：一抗、二抗等。
方法：将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成：细胞－抗体－磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来，再将该柱移出磁场，与结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离目的。
第三节 吞噬细胞的分离和收集
一、Percoll分离法 此法从外周血中分离出单核-巨噬细胞，但由于此类细胞在外周血中的含量较低，分离时所需的血量较多。
二、斑螯敷法
此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细胞。其方法是：用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4~5小时后皮肤局部充血，48小时后局部形成水泡，吸取水泡中的组织液，内含大量巨噬细胞。但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染。
第四节 淋巴细胞的保存和活力测定
1、分离细胞的保存
（1）短期保存
用含有10%~20%灭活小牛血清的 Hanks、Tc-199、 RPMI 1640培养液可保存数周
（2）长期保存及复苏
保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-196℃)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬
液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡站( -80℃)中，继而进行降温(-196℃)冷冻。
复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 ℃温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。
2、细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。
